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摘要：【目的】探討具有健脾清肺、化痰祛瘀作用的中藥復(fù)方仙魚湯對小鼠lewis肺癌生長的抑制作用及其相關(guān)的分子機(jī)制?！痉椒ā繉?0只Lewis肺癌荷瘤小鼠分為仙魚湯高、中、低劑量組（劑量分別為1.747、0.874、0.437g·kg-1·d-1），環(huán)磷酰胺（CTX）組（劑量為20mg·kg-1·d-1），荷瘤模型組；計算各組小鼠平均瘤體質(zhì)量及抑瘤率；制備單細(xì)胞懸液，采用流式細(xì)胞儀檢測各組小鼠Lewis肺癌細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡率；采用免疫組化法檢測各組Lewis肺癌小鼠的bcl2基因的表達(dá)?！窘Y(jié)果】仙魚湯高、中、低劑量組及CTX組瘤體質(zhì)量均低于模型組，腫瘤細(xì)胞凋亡率均高于模型組（P＜0.05或P＜0.01），仙魚湯各組隨著藥物劑量的增大，抑瘤率和腫瘤細(xì)胞凋亡率逐漸增加。仙魚湯高、中、低劑量組及CTX組處于S期的細(xì)胞比例均低于模型組（P＜0.05或P＜0.01），呈現(xiàn)明顯的G0/G1期阻滯現(xiàn)象。仙魚湯各劑量組bcl2染色強(qiáng)度指數(shù)顯著低于模型組（P＜0.01）?！窘Y(jié)論】仙魚湯具有抑制小鼠Lewis肺癌生長的作用，其機(jī)理可能與通過降低bcl2表達(dá)從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞：仙魚湯／藥理學(xué)肺腫瘤／中藥療法細(xì)胞凋亡基因表達(dá)調(diào)控細(xì)胞培養(yǎng)

肺癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一，中醫(yī)藥在肺癌的治療中發(fā)揮著越來越重要的作用。仙魚湯是治療肺癌的經(jīng)驗方，具有健脾清肺、化痰祛瘀之功效，多年的臨床應(yīng)用已證實其具有較好的臨床療效［1-2］。本研究通過動物實驗，進(jìn)一步研究了仙魚湯對小鼠Lewis肺癌生長的抑制作用，并從誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及調(diào)控凋亡相關(guān)基因的角度探討其作用機(jī)理?，F(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1動物C57BL/6J小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22g，SPF級，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供（合格證號：0020535）。

1.2瘤株小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株由中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供，廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)腫瘤研究所長期移植傳代。

1.3藥物與制備仙魚湯組成：仙鶴草15g，魚腥草30g，貓爪草30g，山海螺30g，黨參15g，三七片10g，山慈菇10g，浙貝母15g，守宮5g，天冬15g，黃芪30g，炙甘草5g。由廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥研究中心制備，按照傳統(tǒng)煎煮法煎煮，低、中、高劑量組藥物濃度根據(jù)人與動物體表面積與計量換算法計算［3］，低劑量組1.092g/mL，中劑量組2.184g/mL，高劑量組4.368g/mL，分別相當(dāng)于臨床等效劑量的1、2、4倍。制備后于4℃冰箱中貯存?zhèn)溆?。環(huán)磷酰胺（CTX）注射用粉針劑為山西普德藥業(yè)有限公司產(chǎn)品（批號：20060206），200mg/支，臨用前用生理鹽水溶解，稀釋濃度為2mg/mL，根據(jù)CTX的半數(shù)致死量（LD50）為472mg/kg，注射用量為LD50的1/3～1/5，故小鼠給藥劑量設(shè)為20mg·kg-1·d-1。

1.4主要試劑與儀器碘化丙啶（PI）染液為晶美生物工程有限公司產(chǎn)品；bcl2兔多克隆抗體、即用型過氧化物酶免疫組織化學(xué)染色（SABC）試劑盒（SA1022）均為博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；RPMI1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品；二甲苯、乙醇，均為市售分析純；超凈工作臺（蘇凈集團(tuán)安泰公司）；冷凍桌面離心機(jī)（Eppendorf5810RCentrifuge）；解剖顯微鏡（北京電子光學(xué)設(shè)備廠）；37℃電熱恒溫水浴箱（上海恒豐儀器儀表有限公司）；ALTRA型流式細(xì)胞儀（美國Beckmancoulter公司）；CSⅣ型烤片機(jī)（孝感市電子儀器廠）；億鳴200病理圖像分析系統(tǒng)（中國億鳴）。

1.5Lewis肺癌荷瘤小鼠模型復(fù)制于液氮罐中取出Lewis肺癌細(xì)胞株1支，置于37℃電熱恒溫水浴箱內(nèi)，輕輕搖動令其盡快融化。取出凍存管，用酒精消毒后開啟，用吸管吸出細(xì)胞懸液，注入離心管并滴加體積分?jǐn)?shù)10％小牛血清RPMI1640培養(yǎng)基，常規(guī)離心，制成瘤細(xì)胞混懸液，臺盼藍(lán)計數(shù)約為1×107/mL瘤細(xì)胞。消毒小鼠右前腋，取0.2mL（約1×106～2×106個瘤細(xì)胞）接種于皮下。傳代3次。在無菌條件下剝離Lewis肺癌荷瘤鼠皮下瘤塊，選取生長良好的瘤組織，剪碎、稱質(zhì)量，用細(xì)胞勻漿器制成勻漿，按體積比1：3加生理鹽水制成瘤細(xì)胞混懸液，接種于C57BL/6J小鼠右前肢腋窩皮下，每只0.2mL（約1×106～2×106個瘤細(xì)胞）。

1.6分組及給藥接種24h后隨機(jī)分為5組:仙魚湯高劑量組（劑量為1.747g/kg）、仙魚湯中劑量組（劑量為0.874g/kg）、仙魚湯低劑量組（劑量為0.437g/kg）、CTX陽性對照組（劑量為20mg/kg）、荷瘤模型組。中藥各組均予以0.4mL中藥灌胃，CTX組予以0.2mL腹腔注射，荷瘤模型組予以0.4mL生理鹽水灌胃，均每日1次，給藥14d。

1.7觀察指標(biāo)及檢測方法

1.7.1小鼠生活狀態(tài)觀察實驗過程中觀察小鼠的飲食、毛發(fā)、活動、精神狀態(tài)等情況。

1.7.2抑瘤率末次給藥后24h，Lewis荷瘤小鼠頸椎脫臼處死，用眼科剪分離剝?nèi)∧[瘤，電子天平稱質(zhì)量，計算各組小鼠平均瘤體質(zhì)量及抑瘤率［4］：p抑瘤=（1－m實驗組/m模型組）×100%。

1.7.3細(xì)胞周期分析及細(xì)胞凋亡檢測取小塊瘤組織，加入生理鹽水洗凈血跡后倒掉，再加入1mL生理鹽水，用眼科剪剪碎組織，吸管輕輕吹打，過300目篩，收集單細(xì)胞懸液于流式專用管，加入2mL中性磷酸鹽緩沖溶液（PBS），1300r/min離心5min洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞計數(shù)約1×106/mL，加入體積分?jǐn)?shù)70％冰乙醇2mL吹打后封口固定，保存于4℃冰箱24h。將固定的單細(xì)胞懸液離心，去固定液，加入PBS重新懸浮，洗滌2次，300目篩網(wǎng)過濾1次，加入1mLPI染液（終濃度100mg/L），4℃避光染色30min，流式細(xì)胞儀檢測，收集50000個細(xì)胞，應(yīng)用multicycle軟件分析凋亡率［5］。

1.7.4病理檢查腫瘤組織經(jīng)體積分?jǐn)?shù)10％福爾馬林固定24h后常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡觀察腫瘤生長、腫瘤壞死、間質(zhì)反應(yīng)和腫瘤及腫瘤周圍組織炎癥細(xì)胞浸潤情況并攝片。

1.7.5bcl2陽性表達(dá)檢測采用免疫組化法。常規(guī)石蠟包埋后，4μm厚連續(xù)切片，行SABC法免疫組織化學(xué)染色，用PBS液代替一抗做陰性對照。光學(xué)顯微鏡下觀察，bcl2蛋白染色細(xì)胞漿呈棕黃色為陽性。在高倍鏡視野（400）下隨機(jī)計數(shù)5個視野。計算出各組的染色強(qiáng)度指數(shù)（stainingintensityindex，pSII）。pSII＝（pA強(qiáng)度瘤細(xì)胞×0）＋（pB強(qiáng)度瘤細(xì)胞×1）＋（pC強(qiáng)度瘤細(xì)胞×2）＋（pD強(qiáng)度瘤細(xì)胞×3）。其中A強(qiáng)度代表細(xì)胞漿無特異性染色；B強(qiáng)度代表細(xì)胞漿呈特異性淺棕黃色，染色較淺；C強(qiáng)度代表細(xì)胞漿呈特異性棕黃色；D強(qiáng)度代表細(xì)胞漿呈特異性深棕色，染色較深。染色強(qiáng)度指數(shù)（pSII）的范圍在0～3［6］。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件處理。

2結(jié)果

2.1一般狀況的觀察實驗結(jié)束后，模型組、CTX組小鼠表現(xiàn)為身體瘦小，活動少，喜聚群，毛發(fā)缺少光澤；CTX組小鼠于實驗5～7d開始出現(xiàn)脫毛，進(jìn)食減少；仙魚湯高、中、低劑量組小鼠脫毛現(xiàn)象少于CTX組及模型組，活動力優(yōu)于CTX組及模型組。

2.2各組抑瘤率比較表1結(jié)果表明，仙魚湯高、中、低劑量組及CTX組瘤體質(zhì)量均低于模型組（P＜0.05或P＜0.01）。各仙魚湯組隨著藥物劑量的增大，瘤體質(zhì)量逐漸減輕，抑瘤率逐漸增高。表1各組Lewis肺癌小鼠的瘤體質(zhì)量及抑瘤率比較（略）

Table1Comparisonoftumormassweightandtumorinhibitoryrateindifferentgroups

統(tǒng)計方法：單因素方差分析；①P＜0.05，②P＜0.01，與模型組比較

2.3各組細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期分析仙魚湯高、中、低劑量組及CTX組小鼠Lewis肺癌細(xì)胞凋亡率均高于模型組（P＜0.05或P＜0.01），各仙魚湯組隨著劑量的增大，凋亡率亦逐漸增加。仙魚湯高、中、低劑量組及CTX組處于G0/G1期細(xì)胞的比例均高于模型組，其中仙魚湯高劑量組、CTX組與模型組比較，差異有顯著性意義（P＜0.01）。仙魚湯高、中、低劑量組及CTX組處于S期細(xì)胞的比例均顯著性低于模型組（P＜0.05或P＜0.01），呈現(xiàn)明顯的G0/G1期阻滯現(xiàn)象。仙魚湯高、中、低劑量組及CTX組處于G2/M期細(xì)胞的比例與模型組比較，差異無顯著性意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2、圖1。

2.4光鏡觀察模型組癌細(xì)胞大小和形態(tài)很不一致，可見瘤巨細(xì)胞；癌細(xì)胞核體積增大，細(xì)胞核和細(xì)胞漿比例增大，核的大小、形狀、染色不一，可見巨核、多核，核染色深，核染色質(zhì)呈粗顆粒狀，分布不均勻；核仁肥大，數(shù)目增多，核分裂相增多，可見不對稱性、多極性及頓挫性等病理性核分裂相，間質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞少見（圖2-a）。CTX組可見大片壞死，間質(zhì)見較多的淋巴細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤，纖維組織反應(yīng)性增生（圖2-b）。仙魚湯各劑量組可見癌巢內(nèi)壞死面積增大，間質(zhì)可見淋巴細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤，可見較多的細(xì)胞凋亡小體（圖2-c、d、e）。

2.5各組bcl2染色強(qiáng)度指數(shù)凋亡相關(guān)基因bcl2的陽性產(chǎn)物主要位于細(xì)胞漿，可見大量的細(xì)胞漿棕黃色顆粒染色。仙魚湯各劑量組bcl2的染色強(qiáng)度指數(shù)均顯著低于模型組（P＜0.01），并呈劑量依賴性，而CTX組與模型組比較差異無顯著性意義（P＞0.05）。結(jié)果見表3、圖3。

表2各組小鼠Lewis肺癌組織的細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期分析（略）

Table2Comparisonofcellapoptosisratioandcellcycleanalysisindifferentgroups

統(tǒng)計方法：單因素方差分析；①P＜0.05，②P＜0.01，與模型組比較

a.模型組b.CTX組c.仙魚湯低劑量組d.仙魚湯中劑量組e.仙魚湯高劑量組

圖1各組凋亡率檢測流式細(xì)胞圖譜比較（略）

Figure1Resultsofcellapoptosisratiodetectedbyflowcytometerindifferentgroups

a.模型組b.CTX組c.仙魚湯低劑量組d.仙魚湯中劑量組e.仙魚湯高劑量組

圖2各組腫瘤組織形態(tài)比較（HE染色，×400）（略）

Figure2Morphologicalchangesoftumorcellsunderlightmicroscopeindifferentgroups（HEstaining，×400）

a.模型組b.CTX組c.仙魚湯低劑量組d.仙魚湯中劑量組e.仙魚湯高劑量組

圖3各組bcl2陽性表達(dá)比較（免疫組化，×400）（略）

Figure3Positiveexpressionofbcl2indifferentgroupsdetectedbyimmunohistochemicalmethod

表3各組bcl2染色強(qiáng)度指數(shù)比較（略）

Table3Comparisonofstainingintensityindexofbcl2indifferentgroups

統(tǒng)計方法：單因素方差分析；①P＜0.01，與模型組比較

3討論

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，肺癌發(fā)生發(fā)展的中醫(yī)病機(jī)可以用"痰、瘀、虛"3個字高度概括。其中正虛是肺癌發(fā)生的基礎(chǔ)，《醫(yī)宗必讀》云："積之成者，正氣不足，而后邪氣踞之。"正虛又以脾虛為主，"脾為生痰之源，肺為貯痰之器"。正是脾虛導(dǎo)致痰濁內(nèi)生，進(jìn)一步血停成瘀，瘀血內(nèi)生，痰瘀內(nèi)阻，蘊(yùn)積肺部，日久而發(fā)為本病。

廣州中醫(yī)藥大學(xué)陳銳深教授從肺癌病因病機(jī)出發(fā)，以健脾清肺、化痰祛瘀為治療大法，自擬了治療肺癌的經(jīng)驗方"仙魚湯"。方中君藥為黨參，具有補(bǔ)中益氣、健脾益肺、生津養(yǎng)血的功效，為補(bǔ)益肺脾氣之要藥。黃芪配合黨參，以補(bǔ)肺脾之氣；浙貝母清熱化痰、開郁散結(jié)；貓爪草散結(jié)消腫；三七片化瘀散結(jié)止痛，共為臣藥。仙鶴草收斂止血、解毒抗癌；魚腥草清熱解毒、消癰排膿；天冬養(yǎng)陰清肺生津；山海螺解毒消腫、排膿祛痰；山慈菇清熱解毒、化痰消腫散結(jié)；守宮散結(jié)止痛，共為佐藥。炙甘草調(diào)和諸藥，為使藥。綜合全方，扶正祛邪，攻補(bǔ)兼施，使祛邪而不傷正，共奏健脾清肺、化痰祛瘀之功效。

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展不僅與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化異常有關(guān)，而且與細(xì)胞凋亡的調(diào)控失常有關(guān)。人類細(xì)胞的凋亡機(jī)制十分復(fù)雜，目前已鑒定出了構(gòu)成凋亡途徑的多種成分，揭示出凋亡是受多種基因調(diào)控的，例如p53、p16、cmyc、bcl2、bax等相關(guān)基因均參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)控［7］。bcl2是一種凋亡相關(guān)基因，被激活的bcl2基因的主要作用是抑制細(xì)胞凋亡，下調(diào)bcl2基因的表達(dá)，對腫瘤細(xì)胞有顯著的生長抑制作用。bcl2可能通過阻斷凋亡的公共信號傳遞通路（如抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C）達(dá)到抑制或阻斷多種細(xì)胞及細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡過程。隨著該基因蛋白產(chǎn)物的過度表達(dá)，使得細(xì)胞增殖與凋亡的平衡發(fā)生紊亂，從而阻斷細(xì)胞凋亡的最后共同通道，從而抑制細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致癌變［8－11］。

本研究通過動物移植性腫瘤實驗法探討仙魚湯對Lewis肺癌生長及腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。結(jié)果表明，仙魚湯具有一定的抗腫瘤作用，而且其抑瘤作用隨著劑量的增加而增強(qiáng)。從HE染色的病理切片中發(fā)現(xiàn)，不同劑量仙魚湯組可見癌巢內(nèi)壞死面積增大，間質(zhì)可見較多的淋巴細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤，可見較多的細(xì)胞凋亡小體。進(jìn)一步采用流式細(xì)胞儀檢測凋亡率，結(jié)果表明仙魚湯具有促進(jìn)小鼠Lewis肺癌細(xì)胞凋亡的作用，并且隨著劑量的增加作用也逐漸增強(qiáng)。仙魚湯各劑量組處于G0/G1期細(xì)胞的比例均高于模型組，處于S期細(xì)胞的比例均低于模型組，呈現(xiàn)明顯的G0/G1期阻滯現(xiàn)象，提示仙魚湯可能使G1期細(xì)胞不能通過細(xì)胞周期檢測點進(jìn)入S期，從而發(fā)生G0/G1期阻滯，阻斷DNA復(fù)制，干擾腫瘤細(xì)胞周期正常進(jìn)行，以起到抑制腫瘤的作用。免疫組化檢測結(jié)果顯示，仙魚湯各劑量組bcl2蛋白表達(dá)均顯著低于模型組，并隨著仙魚湯劑量的加大，腫瘤組織bcl2的染色強(qiáng)度指數(shù)也逐漸降低。本研究實驗結(jié)果提示仙魚湯可能通過降低bcl2表達(dá)的途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，對臨床用藥具有一定的指導(dǎo)意義。

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