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本文作者：歐陽冬梅1劉凰1徐金星2劉春華2鄒東旺1楊良波2唐記平1謝克強1作者單位：1.江西廣昌縣白蓮產(chǎn)業(yè)發(fā)展局2.廣昌縣白蓮科學(xué)研究所

我國是蓮的原產(chǎn)地之一，蓮在我國不僅栽培歷史悠久，而且分布廣泛，且是最具特色、栽培面積最大、品種資源最豐富的水生經(jīng)濟作物[1]。迄今為止，中國擁有花蓮品種資源800多個[2]，藕蓮品種和子蓮品種資源分別數(shù)十個。蓮是常異花授粉植物，不同品種間的基因交流很容易通過昆蟲的授粉來完成，導(dǎo)致品種間遺傳資源的混合和品種內(nèi)的遺傳差異較大[3]。目前，我國蓮?fù)N異名現(xiàn)象時有發(fā)生，同一地區(qū)品種單一化現(xiàn)象嚴(yán)重，大大增加了蓮栽培的風(fēng)險性。為了避免這一現(xiàn)象，選取了40份代表性品種（材料）進行SRAP遺傳多樣性分析，以期明確它們的遺傳背景，探討全國各地主要傳統(tǒng)型品種與廣昌縣現(xiàn)有栽培品種的關(guān)系，從而為蓮品種選育提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗所用40份蓮品種（材料）為國內(nèi)外蓮主要產(chǎn)區(qū)在20世紀(jì)初期廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)的優(yōu)異材料。材料取自廣昌縣白蓮科學(xué)研究所博覽園內(nèi)。這40份材料包括野生蓮、全國各地傳統(tǒng)品種、廣昌縣現(xiàn)栽培品種和花蓮品種，材料詳細信息見表1。

1.2樣品制備

采集蓮幼嫩葉片置于塑料袋中（自封袋），再加入變色硅膠，搖動使葉片與硅膠充分均勻接觸。一般來說，硅膠與葉片質(zhì)量比應(yīng)為10∶1，以保證葉片在12h內(nèi)干燥，一旦發(fā)現(xiàn)硅膠從深藍變?yōu)榉奂t，及時更換硅膠，干燥的葉片材料在室溫下保存即可。

1.3DNA的提取

選取上述硅膠干燥的葉片30mg，用液氮磨成粉狀，再用DNA提取試劑盒提取植物基因組DNA。DNA質(zhì)量檢測用1%的瓊脂糖凝膠進行，電泳緩沖液為0.5×TBE，電壓100V，電泳30min。

1.4SRAP分析

PCR擴增反應(yīng)總體積為15μL，反應(yīng)混合液中包括：50ng/μLDNA模板1μL，10×PCRbuffer1.5μL，10mmol/LdNTPs0.6μL，10mmol/L上下游引物各0.5μL，2U/μLTaqDNA聚合酶0.5μL，不足部分用無菌水補充。PCR擴增反應(yīng)程序為95℃5min；95℃1min，35℃1min，72℃1min，5個循環(huán)；95℃1min，50℃1min，72℃1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min，溫度降到4℃即完成擴增。擴增產(chǎn)物加上10μL的上樣緩沖液94℃預(yù)變性5min，采用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠，0.5×TBE緩沖液，65W恒功率電泳1.5h。銀染檢測電泳結(jié)果。

1.5SRAP數(shù)據(jù)處理

對各蓮材料各引物擴增情況作統(tǒng)計，有帶記為無帶記為0，缺失記為2。作矩陣圖輸入計算機，應(yīng)用平均距離法進行聚類分析，并采用NTSYS-pc（Version2.1）軟件處理，建立聚類圖。

2結(jié)果與分析

2.1多態(tài)性分析

從40對SRAP引物中篩選出11對擴增穩(wěn)定、多態(tài)性適中的引物對這40份材料進行擴增，11對引物共擴增產(chǎn)生184條帶，平均每個引物對擴增出16.7條。其中多態(tài)性條帶127條，多態(tài)性頻率為69.0%。不同引物對多態(tài)性頻率差異較大，多態(tài)性頻率最高的為EM14+ME10和EM11+ME10，為100%，多態(tài)性頻率最低的為EM9+ME10，為52.6%（表2）。

2.2指紋圖譜的構(gòu)建

以“0”“1”和“2”分別表示擴增的“有”、“無”和“缺失”，將11對多態(tài)性引物產(chǎn)生的127個多態(tài)性位點進行排序，形成一個數(shù)據(jù)距陣（表3），建立品種計算機化的DNA指紋，以區(qū)分供試品種（材料）。結(jié)果顯示，每一份種質(zhì)都有自己獨特的指紋圖譜。

2.3聚類結(jié)果

根據(jù)這11對多態(tài)性引物的擴增結(jié)果，經(jīng)NTSYS-pc聚類分析，得出品種（材料）間的聚類圖（圖1）。結(jié)果表明，各品種（材料）間相似系數(shù)在0.68～0.93。其中以雪湖貢蓮和馬當(dāng)蓮的相似系數(shù)最大，為0.93，說明它們之間的遺傳差異很小。在相似系數(shù)為0.79的位置，可將參試品種分為三大類。第Ⅰ類包括大部分野生蓮品種和一個花蓮品種（桌上蓮）；第Ⅱ類包括泰國野生蓮Ⅳ、Ⅵ，傳統(tǒng)子蓮品種和一個子蓮花蓮兼用品種（星空牡丹）；第Ⅲ類為花蓮品種。另外，從聚類圖上還可以看出，各種質(zhì)材料的聚類結(jié)果與地理位置有一定的聯(lián)系，來自同一個地方的種質(zhì)除個別外（如泰國野生蓮Ⅳ和Ⅵ），大部分都聚在了一起。這反映出同一個地方的品種材料的親本可能相同或者相近，表明同一地區(qū)品種單一化程度較高。

3小結(jié)與討論

SRAP（特征序列擴增多態(tài)性），以全基因組為靶標(biāo)，通過設(shè)計的引物對ORFs進行擴增，上游引物對外顯子進行特異性擴增，下游引物對內(nèi)含子區(qū)域、啟動子區(qū)域進行特異擴增。與其他分子標(biāo)記相比，該標(biāo)記具有簡便、穩(wěn)定、中等產(chǎn)率的特點，是一種較理想的分子標(biāo)記[4，5]。本研究利用11對SRAP標(biāo)記基本區(qū)分了40份蓮品種材料，證明了SRAP標(biāo)記應(yīng)用于蓮種質(zhì)資源鑒定的可行性。雪湖貢蓮和馬當(dāng)蓮相似系數(shù)為0.93，可能由于供試品種之間很相似，或是因為供試品種較多，而可用的SRAP引物有限，兩者的特異性條帶較少，使這兩個品種未能很好地分開。蓮在我國栽培歷史悠久，依據(jù)其利用目的已明顯演化為三大類群：子蓮、藕蓮和花蓮。在本研究中，40份蓮品種材料也分為三大類，與園藝學(xué)分類系統(tǒng)相吻合[6]，說明蓮三大類型之間遺傳分化十分明顯。本研究中來自全國各地的野蓮材料表現(xiàn)為葉片厚實、花無或少量、不結(jié)實或瓣化，在農(nóng)藝性狀上與藕蓮極其相似，生產(chǎn)上習(xí)慣將它們劃分為藕蓮品種，泰國野生蓮Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ，在農(nóng)藝性狀上也與藕蓮相似，在聚類圖上得到了證實，與野生蓮聚在了第Ⅰ類群。而泰國野生蓮Ⅳ和Ⅵ在農(nóng)藝性狀上與子蓮相似，表現(xiàn)為花多且結(jié)實，在聚類圖中與傳統(tǒng)子蓮品種聚在第Ⅱ類群。這說明泰國野生蓮品種之間遺傳背景差異較大，在利用這些野生蓮品種進行育種時，需根據(jù)育種目標(biāo)的不同，選擇不同的材料做親本。同時也說明，分子鑒定應(yīng)該與形態(tài)學(xué)分類相結(jié)合，兩者互相佐證，才能在分類上更加準(zhǔn)確可信。我們還發(fā)現(xiàn)本研究中的40份蓮品種材料表現(xiàn)出很強的地域相似性，與前人的研究結(jié)果相似[7]，這說明來自同一個地域內(nèi)的品種分化程度低，遺傳多樣性不豐富，極易造成品種單一化，在生產(chǎn)上需多加注意。在本研究中，古代蓮和野生蓮聚成一類，古代蓮是考古出土的千年古蓮子萌發(fā)繁育的后代，野生蓮生長在自然湖泊中，很少有人工馴化積累的變異，而藕蓮在長期的栽培過程中，只以產(chǎn)藕為馴化目的。野蓮分布很廣，前人一致認為野蓮是現(xiàn)在栽培蓮的共同祖先，根據(jù)聚類結(jié)果，野蓮與藕蓮的遺傳差異相對較小，暗示藕蓮可能是由野生蓮直接馴化而來[8]。