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HSP70是HSP家族中最保守和最重要的一類應(yīng)激蛋白，其自身表達水平與生物體受環(huán)境脅迫時細胞組織損傷及自身防御能力關(guān)系密切［9］．鈣網(wǎng)蛋白(calretuculin，CRT)是動物和高等植物體內(nèi)普遍存在且高度保守的一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣結(jié)合蛋白，具有維系細胞Ca2+穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)折疊和細胞凋亡等多種生物學(xué)功能［10］．ilerová等［11］首次克隆蚯蚓Eiseniafetida的CRT基因并鑒定其生物功能．親環(huán)素A(cyclophilinA，cyPA)作為一類具有肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶活性的免疫親和素，主要參與免疫調(diào)節(jié)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并發(fā)揮細胞因子的功能，在細胞生命活動中發(fā)揮重要作用，且對生物體炎癥的發(fā)生、細胞凋亡等具有調(diào)控作用．翻譯控制腫瘤蛋白(translationallycontrolledtumorprotein，TCTP)最初發(fā)現(xiàn)于腫瘤組織，被認為是一個在翻譯水平受到抑制的腫瘤相關(guān)蛋白，而后被發(fā)現(xiàn)是一種普遍存在并且大量表達的蛋白，在進化上高度保守，主要參與細胞周期的調(diào)控，對腫瘤細胞增殖和凋亡具有雙重作用．目前，關(guān)于外源污染物暴露脅迫下蚯蚓特異性蛋白基因表達的研究還較為缺乏．鑒于污染物與生物體之間的相互作用始于分子水平［12，13］，因此，有必要開展分子水平上多環(huán)麝香土壤污染脅迫蚯蚓特異性蛋白基因響應(yīng)表達的研究．本研究以蚯蚓HSP70、CRT、cyPA、TCTP等脅迫蛋白類基因為主要對象，通過檢測分析低劑量AHTN或HHCB長期暴露脅迫下各特異性蛋白基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達量，以期篩選出敏感的分子生物標(biāo)志物，應(yīng)用于多環(huán)麝香污染土壤中亞急性毒性效應(yīng)的早期分子診斷和生態(tài)風(fēng)險評價中．

1材料與方法

1.1供試污染物和供試動物吐納麝香(7-乙?；?1，1，3，4，4，6-六甲基-1，2，3，4-四氫萘，AHTN)購自上海力智生化科技有限公司，純度99%;佳樂麝香(1，3，4，6，7，8-六氫-4，6，6，7，8，8-六甲基環(huán)五-γ-2-苯并吡喃，HHCB)購自天津中科健化工有限公司，純度99%．毒理實驗中采用的蚯蚓為赤子愛勝蚓(Eiseniafetida)，是國際標(biāo)準(zhǔn)毒理試驗?zāi)Ｊ缴镏唬徸阅祥_大學(xué)教研基地天津蘆臺賈立明蚯蚓養(yǎng)殖場．選擇2～3個月齡、有明顯生殖環(huán)帶、體重為400～450mg的已篩選馴化后的成年蚯蚓作為供試受體生物．

1.2實驗方法

1.2.1蚯蚓特異性蛋白基因mRNA表達的RT-qPCR檢測按照試劑盒說明書Trizol法提取蚯蚓總RNA［14］．取1μg總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄酶ReverTraAce-a-(Toyobo，日本)合成cDNA．根據(jù)GenBank已發(fā)表的蚯蚓HSP70、CRT、TCTP、cyPA等基因cDNA序列信息，采用PrimerExpress3.0設(shè)計RT-qPCR擴增引物(表1)．RT-qPCR擴增反應(yīng)體系為20μL，其中SYBRGreenⅠMix(Bio-rad，美國)10μL，ddH2O6.4μL，上下游引物(10μmmol•L－1)各0.8μL，cDNA2.0μL．反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2min，45個循環(huán)(95℃變性15s，55℃退火30s，72℃延伸采集熒光信號30s)．PCR反應(yīng)結(jié)束后熔解曲線分析:95℃1min;60℃1min，60℃30s后，溫度0.5℃•s－1遞升至95℃結(jié)束．PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、連接轉(zhuǎn)化、克隆篩選等操作步驟，任選3個重組質(zhì)粒由北京華大基因公司測序．采用NCBI數(shù)據(jù)庫中BlastX程序?qū)⒐┰嚮蚺c已發(fā)表基因間序列進行同源性比較．

1.2.2AHTN或HHCB28d暴露脅迫下蚯蚓特異性蛋白基因表達供試自然土壤取自天津塘沽森林公園，為未受工農(nóng)業(yè)污染的潔凈表層土壤(0～20cm)，風(fēng)干后過2mm篩待用，土壤理化性狀、污染物土壤背景值以及土壤染毒與配制具體方法見筆者前期研究［7］．根據(jù)AHTN與HHCB土壤亞急性毒性的效應(yīng)濃度［7］，土壤長期暴露實驗染毒濃度設(shè)置5個梯度水平，分別為3、10、30、50和100μg•g－1．早期研究表明［17］，丙酮經(jīng)過充分揮發(fā)后對蚯蚓幾乎無毒性影響，而且去離子水與丙酮對照組中基因表達水平無差異變化，因此，本研究僅設(shè)置丙酮試劑空白作為對照組．每個濃度處理組與對照組均設(shè)置4個平行．暴露28d結(jié)束后，分別于各處理組中任意挑選4條蚯蚓，即每條蚯蚓作為一個待測樣品，重復(fù)4次，進行基因表達水平的定量分析．1.2.3數(shù)據(jù)處理與分析以β-actin作為持家基因，對各供試目的基因mRNA表達水平進行定量分析?；虮磉_數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(mean±SD)的方式表示．?dāng)?shù)理統(tǒng)計均采用SPSS13.0軟件包分析．不同處理組間的比較采用單因素方差分析(ANOVA)，多重比較采用Duncan法，顯著性差異水平為P＜0.05。

2結(jié)果與分析

2.1蚯蚓總RNA的純度與完整度由圖1可見，蚯蚓總RNA完整性較好，其28S與18S條帶清晰;并且RNA的A260/A280比值均在1.8～2.0之間，表明抽提的總RNA純度較高．因此，Trizol法提取RNA可滿足cDNA合成和RT-qPCR反應(yīng)需求．

2.2RT-qPCR引物設(shè)計合理性的驗證通過測序比對結(jié)果可知(表2)，供試基因分別與已收錄的HSP70、CRT、cyPA和TCTP基因序列信息高度相似，表明RT-qPCR引物的設(shè)計可滿足目的供試基因片段擴增檢測要求．各供試基因的熔解曲線皆為特異的單個峰(圖2)，沒有出現(xiàn)引物二聚體與非特異性擴增，更加說明本研究引物設(shè)計以及RT-qPCR反應(yīng)體系條件的建立適用于供試基因的特異性檢測．

2.3AHTN、HHCB28d暴露脅迫下蚯蚓特異性蛋白基因mRNA的響應(yīng)表達暴露于AHTN或HHCB污染土壤28d后，蚯蚓各目的基因HSP70、CRT、cyPA和TCTPmRNA表達變化趨勢如圖3所示．當(dāng)蚯蚓暴露于較低染毒劑量的AHTN(3μg•g－1和10μg•g－1)或HHCB(3、10和30μg•g－1)處理組時，其HSP70基因表達水平無明顯變化;而暴露于較高濃度AHTN(30、50和100μg•g－1)或HHCB(50μg•g－1和100μg•g－1)處理組時，HSP70基因表達水平分別較對照組水平顯著下調(diào)(P＜0.05)．總體而言，AHTN或HHCB長期污染對HSP70基因表達水平均有顯著下調(diào)抑制作用(P＜0.01)．且HSP70基因表達水平與AHTN或HHCB暴露濃度呈負相關(guān)關(guān)系(AHTN:r=－0.829;HHCB:r=－0.717，P＜0.01)．當(dāng)蚯蚓暴露于3、10、50和100μg•g－1的AHTN污染土壤28d后，CRT基因表達量較對照組均顯著性上調(diào)(P＜0.05)，分別為對照組水平的2.2、1.8、5.0和2.0倍．10、30、50和100μg•g－1HHCB暴露處理組中的CRT基因表達水平也均顯著性上調(diào)(P＜0.05)，分別為對照組的2.9、3.2、1.8和2.3倍．與對照組相比較，蚯蚓暴露于AHTN或HHCB污染土壤28d后，各濃度處理組的cyPA和TCTP基因表達水平均無顯著性差異(P＞0.05)．

3討論

目前，由于暫時無法完全獲知污染物脅迫毒性作用的早期反應(yīng)及真正靶位，于是難以對污染物的環(huán)境暴露水平與生態(tài)毒性效應(yīng)給予準(zhǔn)確、及時的預(yù)測評估，而以特定污染物所致生物體表達譜(基因或蛋白質(zhì)水平表達)的改變作為污染物專一暴露的分子生物標(biāo)記物，可以更加靈敏準(zhǔn)確地對環(huán)境中一些持久性有機污染物的生態(tài)安全性做出早期預(yù)警和監(jiān)測評價［19］．本研究發(fā)現(xiàn)暴露于高濃度AHTN或HHCB污染土壤28d后，蚯蚓HSP70基因表達水平受到顯著抑制;與之前濾紙急性毒性試驗結(jié)果相一致，高濃度AHTN或HHCB濾紙接觸染毒48h后，蚯蚓HSP70基因下調(diào)表達，主要是由活性氧自由基引起的氧化應(yīng)激水平所誘導(dǎo)［17］．此外，在某些水生毒理學(xué)研究中也發(fā)現(xiàn)HSP70下調(diào)表達的現(xiàn)象．Lee等［20］研究發(fā)現(xiàn)四氯化碳、殺螟硫磷、壬基苯酚等污染物可抑制水生生物搖蚊幼蟲Chironomustentans的HSP70基因表達．Rhee等發(fā)現(xiàn)壬基酚、辛基酚等脅迫下HSP70基因表達表現(xiàn)為下調(diào)抑制，而雙酚A暴露則會誘導(dǎo)HSP70基因上調(diào)表達，認為其原因是不同種類分泌干擾物暴露脅迫對HSP70基因表達方式可能存在差異［21］．蚯蚓CRT基因表達水平在AHTN或HHCB土壤污染脅迫下表現(xiàn)為顯著誘導(dǎo)上調(diào)，其原因可能是CRT為了行使“分子伴侶”的生理功能或維系機體內(nèi)Ca2+動態(tài)平衡而激發(fā)誘導(dǎo)CRT基因表達［22］．CRT基因的上調(diào)表達也是生物體應(yīng)對氧化應(yīng)激壓力的響應(yīng)方式，是為了防御或降低細胞氧化應(yīng)激損傷效應(yīng)．多環(huán)麝香污染脅迫引起的蚯蚓體內(nèi)活性氧自由基累積，可以起脂質(zhì)過氧化并導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的損傷，從而誘導(dǎo)蚯蚓機體內(nèi)Ca2+水平的迅速提升，而CRT作為Ca2+的調(diào)控基因則表現(xiàn)位持續(xù)的上調(diào)表達［23］．不同種類外源污染物暴露脅迫對cyPA基因表達方式并沒有表現(xiàn)出一定的規(guī)律．Stürzenbaum等［24］研究發(fā)現(xiàn)暴露于Cd、Pb、Zn、Cu等混合重金屬污染土壤6周后，蚯蚓L．rubellus的cyPA基因表達水平顯著增加;而Brulle等［16］研究認為Cd土壤暴露6d后，蚯蚓E．fetida的cyPA基因表達卻被抑制顯著下調(diào)．本研究結(jié)果顯示AHTN和HHCB長期(28d)污染暴露對蚯蚓cyPA基因表達無顯著性影響．因此，cyPA基因尚且不具備作為分子生物標(biāo)志物的特征，不適合用于多環(huán)麝香生態(tài)毒理效應(yīng)的分子診斷．Api等［25］早期研究認為，多環(huán)麝香AHTN或HHCB不具備遺傳毒性致癌物的一些基本特性．本研究也發(fā)現(xiàn)，在AHTN或HHCB污染土壤長期暴露下，蚯蚓翻譯控制腫瘤蛋白基因(TCTP)的表達水平無顯著性變化差異，從側(cè)面說明了AHTN或HHCB沒有顯現(xiàn)可能致癌的特性．

綜上分析，HSP70mRNA水平下調(diào)與CRTmRNA水平上調(diào)的響應(yīng)表達是為了保護蚯蚓抵御自由基氧化應(yīng)激損傷，兩基因有望成為表征多環(huán)麝香土壤污染暴露水平及生態(tài)毒理效應(yīng)的潛在生物標(biāo)志物．考慮到分子毒理學(xué)研究中蚯蚓基因數(shù)據(jù)庫信息相對較少，對于具備潛在分子生物標(biāo)志物特征的特異性基因，還需要開展cDNA全序列克隆及其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析，為豐富蚯蚓基因序列數(shù)據(jù)庫和構(gòu)建蚯蚓基因芯片檢測平臺奠定基礎(chǔ)，進而更有利于拓展多環(huán)麝香污染脅迫下高通量基因表達譜的研究．今后，還必須從生態(tài)毒理基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)角度，綜合分析多環(huán)麝香污染物脅迫下蚯蚓特異性基因表達與調(diào)控的變化，揭示多環(huán)麝香的毒理機制與毒性作用靶位，從而構(gòu)建多環(huán)麝香土壤污染早期預(yù)警的蚯蚓分子診斷技術(shù)體系．

4結(jié)論

(1)RT-qPCR引物的設(shè)計以及PCR反應(yīng)體系條件的建立適用于各供試基因轉(zhuǎn)錄水平表達的特異性檢測．(2)AHTN或HHCB土壤污染暴露脅迫下，蚯蚓HSP70基因表達水平受到顯著抑制，而CRT基因表達水平顯著誘導(dǎo)上調(diào);cyPA和TCTP基因表達水平均無顯著性變化．(3)HSP70與CRT兩基因?qū)⒂锌赡茏鳛闈撛谏飿?biāo)志物，可應(yīng)用于預(yù)測和評估土壤多環(huán)麝香污染水平及生態(tài)毒性效應(yīng)．

作者：陳春劉瀟威鄭順安周啟星李松單位：農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所農(nóng)業(yè)部產(chǎn)地環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品安全重點開放實驗室南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院環(huán)境污染過程與基準(zhǔn)教育部重點實驗室中國石油冀東油田公司油氣集輸公司