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免疫組化范文第1篇

【關(guān)鍵詞】:小鼠組織;免疫組化技術(shù)

【中圖分類號】R392.33【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A【文章編號】1007-8517(2010)06-034-1

醫(yī)學(xué)研究和科研領(lǐng)域經(jīng)常會應(yīng)用動物模型來進(jìn)行研究,以此來探索人類疾病的模擬反應(yīng)。在過去一個世紀(jì)的研究中,小鼠已經(jīng)成為建立人類疾病的動物模型的最佳實驗材料。當(dāng)科研人員應(yīng)用小鼠做為研究對象時,往往采用免疫組織化學(xué)的方法對小鼠組織進(jìn)行鑒定和分析。但是由于免疫組化操作的影響因素諸多,免疫組化效果不穩(wěn)定等因素常常困擾著免疫組化操作者。本文就以上相關(guān)問題進(jìn)行了簡單的總結(jié)和分析。

1小鼠組織的應(yīng)用

小鼠經(jīng)常被用作動物模型進(jìn)行科學(xué)研究,因為現(xiàn)在小鼠的基因改造技術(shù)越來越成熟,并且它的生理生化及發(fā)育過程類似于人類,基因組也和人類有90%同源,所以小鼠模型可以基本上真實模擬人類的功能活動和反應(yīng);小鼠作為遺傳學(xué)研究材料的另一優(yōu)勢還在于其基因組計劃已基本完成[1]?；蚪M序列的大量信息為研究基因功能及其表達(dá)調(diào)控、胚胎發(fā)育和人類疾病的分子機(jī)制提供了條件基礎(chǔ)和技術(shù)手段。

2免疫組化的原理及優(yōu)點

免疫組化技術(shù)是在組織化學(xué)的方法上結(jié)合免疫學(xué)的理論和技術(shù)發(fā)展起來的一門新技術(shù),能將形態(tài)、代謝和功能密切結(jié)合起來。簡單地說,用已知的抗原或者抗體去檢測待檢組織中的抗原或抗體,其結(jié)合后經(jīng)一系列方法的處理,出現(xiàn)呈色反應(yīng),這樣在光鏡下就可以確定組織的來源屬性和部位。免疫組化技術(shù)還有著以下的優(yōu)點。(1)特異性強(qiáng),抗原抗體的結(jié)合具有高度特異性;(2)敏感性高。由于ABC發(fā)或SP法的出現(xiàn)時抗原抗體的結(jié)合更敏感;(3)定位準(zhǔn)確,免疫組化技術(shù)可在組織和細(xì)胞內(nèi)準(zhǔn)確定位。

3實驗中存在的問題及注意事項

3.1組織的預(yù)處理

因為小鼠模型都十分珍貴,所以我們在試驗中應(yīng)盡量減少失敗的幾率。首先,小鼠組織的剝離要迅速,固定要及時,否則很多組織比如腦組織很容易被破壞。其次,固定時間要適當(dāng)。固定時間以常溫下6-12小時為宜。過度固定可能導(dǎo)致組織抗原的損失,影響實驗效果[2,3]。最后,組織的脫水時間要適當(dāng)。拿裸鼠為例,因為其組織比較柔嫩,所以脫水時應(yīng)該從低濃度乙醇開始,比如50%乙醇梯度開始,并且適當(dāng)縮短脫水,透明的時間,防止小鼠組織變形,變脆變硬,影響后面的切片和形態(tài)觀察。

3.2免疫組化實驗步驟

免疫組織化學(xué)技術(shù)是多步驟、多因素決定的實驗方法,任何一個環(huán)節(jié)稍有不慎,都直接影響免疫組化的結(jié)果。下面從以下幾個方面進(jìn)行闡述:(1)抗原修復(fù)。由于小鼠組織在福爾馬林或其他固定液中會引起蛋白內(nèi)或蛋白間亞甲基橋的橋連,導(dǎo)致許多抗原簇被封閉。所以,需要先進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露。試驗中應(yīng)該根據(jù)具體組織和抗體選擇最佳的修復(fù)方法。(2)減少或消除非特異染色。一般小鼠組織中免疫組化的非特異染色較深,常常干擾實驗結(jié)果的觀察。我們應(yīng)該從以下方面盡量避免:①抗體濃度要適合。試驗中通過設(shè)計梯度稀釋抗體來確定最佳抗體稀釋濃度?？贵w濃度過高也會產(chǎn)生非特異染色。②PBS洗滌要充分。試驗中盡量使用新鮮的PBS,每次的洗滌時間也要嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。③實驗用的封阻血清要確保與一抗同源,封阻時間也要足夠。④實驗的整個過程中都要確保組織不能干掉。(3)DAB顯色:對二甲胺基偶氮苯(DAB)顯色的時間也不同程度影響免疫組化的最終效果。最好顯微鏡下控制顯色,所以操作者應(yīng)具備一定的常用抗體定位的知識,不要顯色時間太長,如果無陽性物質(zhì),顯色時間過長無益,只能使假陽性的機(jī)率倍增。

3.3結(jié)果的判斷和分析

免疫組化染色結(jié)果的判斷應(yīng)該是陽性染色強(qiáng)而非特異染色很淡或無,兩者形成鮮明的對比,陽性標(biāo)記物的位置準(zhǔn)確(核、質(zhì)、膜、血管壁或間質(zhì)等),細(xì)胞邊界清楚。判斷根據(jù):根據(jù)陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度:(無著色細(xì)胞)(一),(+),(+ +),(卅)。免疫組化染色結(jié)果還要結(jié)合組織形態(tài)學(xué)判斷是真正的陽性染色而非其他著色。另外實驗的進(jìn)行還必須設(shè)有對照,比如陽性對照,陰性對照,自身對照等,這對結(jié)果的分析很重要。

4總結(jié)

總之免疫組化是一項很精確的實驗技術(shù)。它在小鼠組織研究上的應(yīng)用有著很重要的科研價值和潛力。近年來,由于檢測技術(shù)敏感性的不斷增強(qiáng);單克隆抗體的制備;基因庫的建立;以及修復(fù)抗原性的各種措施、特別是熱預(yù)處理法的出現(xiàn)與發(fā)展,使得免疫組化技術(shù)的使用邁出了嶄新的一步。雖然該技術(shù)也同時存在很多困難,但是只要我們認(rèn)真操作每一個步驟,一定能做出高質(zhì)量的小鼠的免疫組化切片并且得到有用的實驗結(jié)果。

參考文獻(xiàn)

[1] 范爾鐘,李穎,劉仲燕.免疫組化技術(shù)在實驗動物組織中的應(yīng)用體會[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志,2005,21(1).

免疫組化范文第2篇

[關(guān)鍵詞] 胃腸間質(zhì)瘤；免疫組化；c-kit；血小板源性生長受體α基因

[中圖分類號] R735

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A

[文章編號] 1674-0742（2015）07（b）-0008-02

胃腸間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumors，CISTs）是消化道最常見的間葉源性腫瘤，組織學(xué)上由梭形細(xì)胞、上皮樣細(xì)胞、偶或多形性細(xì)胞排列成束狀或彌漫狀，由突變的c-kit或PDGFRA基因驅(qū)動，可見于消化道的任何位置。過去，多數(shù)CISTs被診斷為平滑肌或神經(jīng)源性腫瘤，1983年Mazur等首次提出CISTs的概念。目前，CISTs的診斷依賴于結(jié)合組織形態(tài)學(xué)、CD117和DOG1免疫組化檢測以及c-kit和PDCFRA基因突變的檢測。該研究回顧性分析2013年1月-2015年1月收集的南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院的110例CISTs的臨床病理特點，并運用免疫組化方法檢測Dog-l、CD117、CD34、SMA、Sl00的表達(dá)，其中8例包含c-kit、PDGFRA基因突變檢測結(jié)果，探討免疫組化結(jié)合基因檢測對CISTs的診療價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院白2013年1月-2015年1月經(jīng)手術(shù)或內(nèi)鏡下切除的資料完整、診斷明確的原發(fā)性GISTs患者組織標(biāo)本110例。

1.2 免疫組化檢測

所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醉固定，常規(guī)石蠟包埋，切片。免疫組化采用sP兩步法，試劑均購白福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。參照產(chǎn)品說明書進(jìn)行實驗，常規(guī)設(shè)置陽性和陰性對照。結(jié)果判定：陽性表達(dá)部位定位準(zhǔn)確，Dog-1、CD117、CD34陽性細(xì)胞數(shù)平均≥10%為陽性。

1.3 基因突變檢測

按照試劑盒（OMEGA，USA）說明提取石蠟組織中的基因組DNA，運用合適的引物PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）擴(kuò)增c-kit基因外顯子9、11、13、17和PDCFRA基因外顯子12、18。PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳確定后，用ABI 3500測序儀行序列分析。應(yīng)用SeqScape v2.7軟件判斷基因突變情況。

2 結(jié)果

2.1 臨床及病理特征

110例患者中，男56例，女54例。年齡22～89歲，中位年齡59歲。腫瘤發(fā)生部位：胃74例（67.3%），小腸2l例（19.1%），結(jié)直腸6例（5.5%），食管6例（5.5%），胃腸外（腹膜后、盆腔）3例（2.7%）。根據(jù)文獻(xiàn)將腫瘤行危險度分級：極低組47例（42.7%），低組25例（22.7%），中等組10例（9.1%），高組28例（25.5%）。腫塊最大直徑范圍0.3～20cm，平均直徑4.6cm。110例患者中梭形細(xì)胞型92例（83.6%），上皮樣型7例（6.4%），混合細(xì)胞型11例（10%）。

2.2 免疫組化結(jié)果

110例中CD117、Dog-l、CD34、SMA、Sl00的陽性例數(shù)分別為102（92.7%）、103（93.6%）、87（79.1%）、49（44.5%）、9（8.2%）（表1）。CD117、Dog-1、CD34大部分為彌漫性表達(dá)。8例CD117陰性病例中，7例Dog-l陽性。SMA、Sl00大部分為局部或局灶陽性。

2.3 基因檢測結(jié)果

8例GIST（中等風(fēng)險1例，高風(fēng)險7例；胃4例，小腸3例，直腸1例）行c-kit、PDCFRA基因突變檢測，總體突變率100%（8/8）。其中c-kit突變率75%，PDGFRA突變率100%（表2）。c-kit突變結(jié)果提示4例應(yīng)用伊馬替尼可能有積極療效，2例可能產(chǎn)生耐藥或敏感性降低，2例療效不明確。PDGFRA檢測結(jié)果對伊馬替尼療效預(yù)測尚需要進(jìn)一步臨床觀察。8例GIST中，6例CD117陽性。其中一例CD117、Dog-l雙陰性，c-kit第9外顯子插入突變。3討論

GISTs是消化道最常見的間葉源性腫瘤，在中國，估計年發(fā)病率約為10-20/100萬，其中10%～30%為惡性。本研究中，中高等風(fēng)險組占34.6%。CIST可發(fā)生于消化道任何部位，部分患者可發(fā)生于消化道外。該研究中，胃部發(fā)生率最高（67.3%），小腸其次（19.1%）。

GISTs具有非定向分化特征，因不同瘤體的組織分化程度存在差異，故其表現(xiàn)出的形態(tài)學(xué)以及組織學(xué)特征也不同。該研究中梭形細(xì)胞型占83.6%，上皮樣型占6.4%，混合細(xì)胞型占10%。在組織學(xué)上，GISTs與其他間葉源性腫瘤相似，難以與平滑肌腫瘤、神經(jīng)纖維瘤等鑒別。免疫組化診斷以往依賴CD117、CD34的表達(dá)。近年來，隨著研究的進(jìn)展，DOC1已成為GISTs診斷的重要分子標(biāo)記物。在該研究的110個病例中，CD117、Dog-1、CD34的陽性率分別為92.7%、93.6%、79.1%，在8例CD117陰性的病例中，7例Dog-1陽性。CD117、Dog-l、CD34三者聯(lián)合應(yīng)用可區(qū)分出絕大部分的GISTs。

免疫組化范文第3篇

【摘要】 目的:用兩種不同的免疫組化方法二步法和三步法分別在胃癌組織中進(jìn)行ERα-36染色結(jié)果的比較，尋求不同免疫組化原理的染色試劑盒對實驗結(jié)果的影響。方法： 利用兩種不同的試劑盒研究相同的胃癌微陣列芯片（共352點，以肝組織作為定位標(biāo)志），通過比較兩種免疫組化方法在相同組織上表達(dá)的不同做比較。結(jié)果： 三步法制片結(jié)果比二步法背景低，陽性率低，非特異性著色小，結(jié)果明確易讀；而二步法較三步法操作簡單，檢查陽性率高，陽性強(qiáng)度高。結(jié)論： 針對一抗為ERα-36的免疫組化染色，三步法雖然實驗耗時比較長，但實驗結(jié)果較好，明確易讀，適合科學(xué)研究。二步法較易出結(jié)果，靈敏度較高，陽性強(qiáng)度高，較易出背景著色，假陽性率高，故不適于科學(xué)研究，但因為操作方便，檢出陽性率較三步法高，對于ERα-36弱表達(dá)的病例不容易漏診，且能較快出結(jié)果，故可考慮在臨床病理診斷中選擇應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】 免疫組化技術(shù); 二步法; 三步法； 組織芯片技術(shù)

免疫組織化學(xué)技術(shù)是利用已知的特異性抗體與抗原的特異性結(jié)合來檢測組織或細(xì)胞內(nèi)某種物質(zhì)的性質(zhì)，并利用酶作用于底物所產(chǎn)生的顏色反應(yīng)來顯示某種物質(zhì)的分布于細(xì)胞內(nèi)定位的一種技術(shù)，自建立免疫酶標(biāo)技術(shù)以來，這門技術(shù)得到了迅速發(fā)展，在科研和臨床診斷已被廣泛應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)部分胃癌為雌激素受體依賴性［1］。但一張好的免疫組化切片需要真陽性染色結(jié)果表達(dá)在預(yù)期對應(yīng)的組織細(xì)胞中，定位清晰準(zhǔn)確，間質(zhì)清楚，無或少背景著色［2］。影響免疫組化的結(jié)果有很多，如組織固定、脫水的過程、修復(fù)的好壞以及免疫組化的過程和免疫組化試劑盒的選取以及顯色步驟均對結(jié)果有影響［3］。目前研究影響免疫組化結(jié)果的因素多從免疫組化試劑盒以外幾方面分析，對不同原理的試劑盒對實驗結(jié)果的影響研究甚少。本研究擬以ERα-36為目的指標(biāo)，觀察免疫組化兩步法和三步法在ERα-36檢測中的異同，探討兩種方法在使用中的優(yōu)缺點。

1 材料和方法

1.1 材料

由江漢大學(xué)腫瘤教研室構(gòu)建352點胃癌組織芯片，以正常肝組織作為定位標(biāo)記，芯片直徑0.6㎜，片厚4um。

ERα-36兔抗人多克隆抗體，由Creighton大學(xué)王兆一教授提供，以胞漿著色為陽性。三步法SP超敏試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，二步法PV-9000試劑盒購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

選用已知陽性的正常乳腺組織為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。DAB顯色，染色步驟嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。蘇木素復(fù)染核。

以三步法為例，具體操作如下：

① 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水化，用PBS（pH 7.4）沖洗3次，每次3min；

② 用EDTA緩沖液浸泡(pH 8.0)，高壓修復(fù)2min，使抗原暴露；

③ 每張切片加150μl過氧化酶阻斷溶液（試劑A），室溫下孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，每次3min；

④ 除去PBS液，每張切片加150μl正常非免疫動物血清（試劑B），室溫下孵育10min；

⑤ 除去血清，每張切片加150μl的第一抗體，4℃過夜；

⑥ PBS沖洗3次，每次3min，除去PBS液，每張切片加150μl生物素標(biāo)記的第二抗體（試劑C），室溫下孵育10min， PBS沖洗3次，每次3min；

⑦ 除去PBS液，每張切片加150μl鏈霉菌抗生物素-過氧化酶溶液（試劑D），室溫下孵育10min，PBS沖洗3次，每次3min；

⑧ 除去PBS液，每張切片加600μl的新鮮配制的DAB，顯微鏡下觀察3～10min；

⑨自來水沖洗，蘇木素復(fù)染 ，自來水沖洗返藍(lán)或沖洗后用PBS快速返藍(lán)；

⑩ 梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。

兩步法④至⑦步驟與三步法不同，不用正常血清封閉，直接滴加一抗過夜，然后直接滴加聚合了辣根過氧化物酶的特異性二抗，余步驟相同。

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1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用卡方檢驗，所有統(tǒng)計學(xué)采用SPSS13.0完成，P＜0.05為差異有顯著意義。

2 結(jié)果

采用免疫組化三步法對胃癌組織芯片ERα-36進(jìn)行處理后的染色結(jié)果均為漿著色，無核表達(dá)。染色結(jié)果為癌組織顯示棕黃色的顆粒，背景清晰。根據(jù)芯片上顯色結(jié)果的深淺我們對其進(jìn)行了4個等級的評定：癌細(xì)胞胞漿無著色-;癌細(xì)胞胞漿上出現(xiàn)淡黃色染色顆粒+;癌細(xì)胞的胞漿上出現(xiàn)深棕黃色的染色顆粒為+++；介于+與+++之間染色深度為++。ERα-36的陽性率為(52/111)46.85%，其各個等級表達(dá)率見表1。

采用免疫組化二步法對胃癌組織芯片ERα-36分別進(jìn)行處理后，閱片標(biāo)準(zhǔn)同三步法。結(jié)果均為漿著色，無核表達(dá)。ERα-36的陽性率為(105/111)94.59%，其各個等級表達(dá)率見表1。表1 二步法與三步法陽性率的比較由表1可見，二步法與三步法各個等級免疫組化ERα-36的陽性率存在顯著差異，兩步法高于三步法。

此外，我們通過使用二步法和三步法對ERα-36進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn)，三步法檢測結(jié)果的背景較二步法低，非特異性著色小，檢查出的陽性率低于二步法，且費用相對較少；但二步法步驟少，耗時較少，且無內(nèi)源性生物素的干擾，檢出的陽性率高，染色強(qiáng)度高，見表2。表2 二步法與三步法比較

3 討論

關(guān)于胃癌的ER陽性率國外報道為23%（30/130）(免疫組化法)［4］，國內(nèi)外多項研究發(fā)現(xiàn)ERα-36在胃癌中表達(dá)。

二步法又稱非生物素酶法。該方法中的第二抗體是將特異性的抗體和辣根過氧化物酶通過一個多聚糖骨架聯(lián)接成一個多聚體。PV系列二步法免疫組化檢測試劑將二抗抗體分子和酶聚合在氨基酸骨架上，形成多聚體，替代傳統(tǒng)方法中的二抗和三抗，直接放大抗原抗體結(jié)合的信號，避免再使用生物素。然后通過DAB呈色反應(yīng)來觀察抗原表達(dá)部位。

三步法又稱生物素酶法。我實驗室采用SP超敏試劑盒是根據(jù)鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶（Streptavidin-Peroxidase）鏈接系統(tǒng)設(shè)計的。第二抗體采用生物素標(biāo)記；鏈霉菌抗生物素蛋白（SA）是從鏈霉菌中分離出的蛋白質(zhì)，分子量為60KD，它含有四個亞基，每個亞基都有與生物素（Biotion）連接的部位，且兩者之間有很強(qiáng)的親和力。SA與過氧化物酶形成SA-過氧化物酶復(fù)合體；生物素化的二抗與SA-過氧化物酶復(fù)合體，可通過DAB的呈色反應(yīng)來顯示抗原抗體結(jié)合部位。

我們對芯片的染色結(jié)果進(jìn)行比較和討論，發(fā)現(xiàn)用三步法進(jìn)行染色的芯片結(jié)果明確易讀，而二步法陽性率普遍較高，非特異性著色率高。

免疫組化三步法染色非特異性著色率比二步法低的原因可能是:①三步法加一抗前用血清封閉去掉內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾， 而PV二步法省了這一步，因此SP三步法非特異性著色率低；②二步法靈敏度高，第一抗體4℃過夜容易導(dǎo)致背景著色。因此，三步法的假陽性率（假陽性指所有切片均呈陽性反應(yīng)，或一組抗體均在同一組織細(xì)胞的胞質(zhì)或胞核呈陽性反應(yīng)，另外切片邊緣、刀痕，皺褶區(qū)和擠壓區(qū)呈現(xiàn)的陽性反應(yīng)）［5］低于二步法，故對于實驗室研究檢測ERα-36的陽性表達(dá)率適合采用三步法以避免誤差。但是三步法耗時較長，步驟較多，對操作人員要求較高，且對于陽性表達(dá)率較低的病例不容易檢出，故在這方面二步法比較有優(yōu)勢，二步法法靈敏度較高，不容易漏診，且無內(nèi)源性生物素的干擾，DAB顯色較快，顧較適合臨床快速診斷使用。我實驗室研究的是胃癌上一抗為雌激素受體ERα-36時的染色結(jié)果，對于檢測其它指標(biāo)二步法和三步法檢測結(jié)果是否也有顯著性差異還有待于進(jìn)一步研究。

【參考文獻(xiàn)】

1 Nicolson GL. Cancer metastasis : tumor cell and host organ properties important in metastasis to specific secondary sites.Biochim Biophys Acta ，1988 ，948（2） :175~224.

2 張銘，司少艷，韓瑞剛，等. 免疫組化SP法與PicTureTM兩步法的比較. 診斷病理學(xué)雜志，2004，11 (1):58~59.

3 劉樺，趙靜.病理免疫組化染色方法質(zhì)量控制應(yīng)注意的基本問題.中國煤炭工業(yè)學(xué)雜志，2006，9(12):1246~1247.

4 Kojima O ，Takhashi T ，Kawakami S， et al. localization of estrogen receptors in gastric cancer using immunohistochemical staining of monoclonal antibody cancer ，1991 ，67（9） : 2401~2406.

免疫組化范文第4篇

【關(guān)鍵詞】 抗原修復(fù)液；固定時間；免疫組化

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2012.08.089 文章編號：1004-7484（2012）-08-2487-02

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)和相關(guān)領(lǐng)域的不斷發(fā)展，免疫組織化學(xué)技術(shù)作為一門新興的學(xué)科出現(xiàn)了。它是一門基于免疫和分子生物學(xué)與病理形態(tài)學(xué)等學(xué)科綜合的技術(shù)，主要是通過已知抗體或抗原進(jìn)行對實驗中的組織細(xì)胞中探測的抗原或抗體檢測。典型特征包括操作易于實現(xiàn)，準(zhǔn)確性高和特異性強(qiáng)，并且能夠?qū)⑿螒B(tài)和機(jī)能相互整合。該種技術(shù)已在實際中能夠進(jìn)行病理和鑒別診斷，組織胚胎和神經(jīng)解剖等相關(guān)領(lǐng)域的實驗研究[1]。通常情況下，只有在正確及時的固定離體組織前提下，免疫組化技術(shù)才能得出精確度高的實驗結(jié)果。但是，由于實際操作中存在大量的影響因素造成不能正確及時的固定離體組織，特別是在進(jìn)行尸檢標(biāo)本時，對實驗的要求更高。本文的研究重點就是考察這些組織是否能夠做免疫組化實驗，對于不同抗原修復(fù)液和固定時間對免疫組化結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料 采集本院在2008年1月至2009年12月手術(shù)中送檢，并且確診為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌的26例標(biāo)本。在實驗中，每一標(biāo)本中選取4塊腫塊部位，其中的四個時間點分別是：t1，t2，t3和t4。t1，t2，t3和t4分別代表立即固定組，延遲12小時固定組，延遲24小時固定組，延遲48小時固定組。將其中的1塊標(biāo)本馬上置于10%的中爾馬林液中進(jìn)行固定，并將實驗中的其余3塊分別于延遲12、24、48小時后放入10%中爾馬林液進(jìn)行固定。然后對于以上標(biāo)本固定滿24小時后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟和包埋相關(guān)操作，再進(jìn)行切片行HE染色驗證腫瘤組織。并且將染色結(jié)果為陰性者立即固定組免疫組化，同時不再做與其相應(yīng)延遲固定組的標(biāo)本標(biāo)記染色。

1.2 試劑與方法 采用的試劑包括：鼠抗人CK7單抗，抗人C-erbB-2，單抗兔抗人ER單抗和鼠及ElivisionTM plus（即用型檢測試劑盒和DAB試劑盒均購于福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。采用兩步法進(jìn)行免疫組化，即分別用檸檬酸高壓熱修復(fù)和胃酶修復(fù)，并且嚴(yán)格按照ElivisionTM plus試劑盒要求的操作步驟進(jìn)行操作。其中，脫水透明，中性樹膠封片，DAB顯色和蘇木素輕度復(fù)染，并且用PBS進(jìn)行替換一抗作為陰性對照。其中，不同抗原修復(fù)液分組：pH為9.0的高溫高壓EDTA緩沖液修復(fù)（A），pH為8.0高溫高壓EDTA緩沖液修復(fù)（B），pH為6.0高溫高壓檸檬酸鹽緩沖液修復(fù)（C），pH為9.0微波爐EDTA緩沖液修復(fù)（D），pH為8.0微波爐EDTA緩沖液修復(fù)（E），pH為6.0微波爐檸檬酸鹽修復(fù)法（F）。

1.3 結(jié)果判定 進(jìn)行陽性定位在細(xì)胞漿和陽性定位在細(xì)胞核的免疫組化切片，將其中具有特征代表的10個在400倍視野中觀察，對其中的陽性細(xì)胞占整體細(xì)胞的比例進(jìn)行計數(shù)如下：計陽性細(xì)胞數(shù)占整體細(xì)胞比例在25%以下記做（±），占整體細(xì)胞比例在25%-50%記做（+），占整體細(xì)胞比例在50%-75%記為（++），占整體細(xì)胞比例在75%以上記為（+++），并且相應(yīng)的評價分為1，2，3，4分；同樣的，以（±），（+），（++）表示染色強(qiáng)度，并且相應(yīng)的評價分為1，2，3分。最后，將兩種記分乘積作為染色效果指數(shù)。另外，對陽性定位于細(xì)胞膜的免疫組化進(jìn)行切片，其中的染色效果參照文獻(xiàn)[2]標(biāo)準(zhǔn)判定，同樣的以符號±，+，++，+++，++++進(jìn)行評價，并且相應(yīng)的評價分為1，2，3，4，5分，將兩種分?jǐn)?shù)的乘積作為染色效果指數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 基于統(tǒng)計軟件SPSS13.0進(jìn)行數(shù)字統(tǒng)計處理。在進(jìn)行統(tǒng)計中，進(jìn)行隨機(jī)區(qū)間設(shè)計的秩和檢驗，并將檢驗結(jié)果在P

2 結(jié) 果

2.1 通過在A-F抗原修復(fù)液以及固定時間不同乳癌組織中，CK7的表現(xiàn)結(jié)果如下：在乳癌組織中，CK7的陽性顯示為黃褐色的顆粒，其定位于細(xì)胞漿中，在總共26例標(biāo)本中立即固定組均陽性。并且，在立即固定組、12小時后固定組、24小時后固定組和48小時后固定組間的染色效果指數(shù)差異，有統(tǒng)計學(xué)意義（P

2.2 通過在A-F抗原修復(fù)液以及固定時間不同乳癌組織中，ER的表現(xiàn)結(jié)果如下：在乳癌組織，ER的陽性顯示為黃褐色顆粒，其定位于細(xì)胞核中，在所有的標(biāo)本中有22例立即固定組標(biāo)本呈現(xiàn)出了陽性。在立即固定組、12小時后固定組、24小時后固定組和48小時后固定組間的染色效果指數(shù)之間的差異P

2.3 通過在A-F抗原修復(fù)液以及固定時間不同乳癌組織中，C-erbB-2的表現(xiàn)結(jié)果如下：在乳癌組織，C-erbB-2陽性顯示為黃褐色顆粒，并且陽性定位在細(xì)胞膜中，在所有的標(biāo)本中有18例立即固定組標(biāo)本呈現(xiàn)陽性。在立即固定組、12小時后固定組、24小時后固定組和48小時后固定組間的染色效果指數(shù)之間的差異P

3 討 論

由組織病理學(xué)基本理論可知，無論在組織切片活著進(jìn)行電鏡大體標(biāo)本的保存，應(yīng)該及時適當(dāng)進(jìn)行有效的固定。通過這種操作，才能達(dá)到使組織和細(xì)胞內(nèi)蛋白凝固并能夠在特定位置保留，進(jìn)而可以防止破壞及自溶內(nèi)外源性酶，從而最大程度的對組織和細(xì)胞的固有形態(tài)、結(jié)構(gòu)實施了保護(hù)。當(dāng)出現(xiàn)組織內(nèi)沒未能進(jìn)行有效的固定時，內(nèi)外源性酶將能夠造成組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，甚至使某些特定部位的蛋白向周圍擴(kuò)散并出現(xiàn)降解。在本實驗中，通過采用不同抗原修復(fù)液，并采用在延遲時間不等的固定組織，進(jìn)行特定部位的蛋白免疫組化檢測，在結(jié)果中可以看到特定陽性部位周圍有不同的化程度的陽性背景。并且，在進(jìn)行CK7免疫標(biāo)記時，癌巢周圍陽性背景隨著抗原修復(fù)液A到F，固定時間的增長而逐漸加深；在進(jìn)行ER免疫標(biāo)記過程中，在核陽性減弱的同時出現(xiàn)胞漿的陽性背景；在進(jìn)行C-erbB-2免疫標(biāo)記過程中，胞膜陽性同時胞膜兩側(cè)均出現(xiàn)陽性背景。并且，從統(tǒng)計學(xué)角度，在CK7、ER和C-erbB-2在4組固定時間不等的乳癌組織間的表達(dá)效果具有統(tǒng)計意義。

免疫組織化學(xué)技術(shù)基本原理：基于抗原抗體反應(yīng)或者組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，通過借助顯色劑來標(biāo)記特異性抗體在組織細(xì)胞原位，從而能夠?qū)ο鄳?yīng)抗原進(jìn)行定性、定位和定量診斷。其中，組織固定不理想對于免疫組化染色結(jié)果有非常大的關(guān)系，其固定的結(jié)果程度和抗原保存有直接關(guān)系，因此應(yīng)該進(jìn)行盡快組織固定。在進(jìn)行大標(biāo)本和有包膜的標(biāo)本實驗時，由文獻(xiàn)[3，4]應(yīng)該進(jìn)行切開固定。在其中的組織細(xì)胞不能及時有效固定，就會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白破壞降解，甚至導(dǎo)致免疫組化檢測失敗[5，6]。免疫組化染色中，組織結(jié)構(gòu)的保存和抗原性等的改變程度有多方面的影響因素，主要包括：溫度、抗原、固定液的pH值、固定劑種類、灌注速度和進(jìn)行固定后處理方法等方面。

在本實驗中，所選用得CK7、ER和C-erbB-2抗體，進(jìn)行了在不同抗原修復(fù)液，在立即固定、延遲12小時固定、延遲24小時固定和延遲48小時固定的4組乳癌組織中，并且最終標(biāo)記了細(xì)胞漿、細(xì)胞核和細(xì)胞膜等部位的相應(yīng)蛋白。通過實驗看出，在抗原修復(fù)液E和F及在延遲48小時中的不到明確的膜陽性。因此，延遲固定對膜蛋白免疫組化效果的影響更明顯。延遲固定大幅弱化了免疫組化效果，其中的原因可能是延遲固定和內(nèi)外源性蛋白酶對部分蛋白的降解，以及部分蛋白向周圍擴(kuò)散造成?？乖迯?fù)液E和F延遲固定太長，不太適宜進(jìn)行檢測，而抗原修復(fù)液A、B、C和D可以進(jìn)行延遲固定組織免疫組化檢測。可以得出，盡管在實驗中免疫組化效果變差，但是可以分辨出特定部位的陽性結(jié)果。因此，對延遲固定組織只要充分固定和選用抗原修復(fù)液抗原修復(fù)液A、修復(fù)液B、修復(fù)液C和修復(fù)液D可以做免疫組化檢測的，同時應(yīng)注意減少實驗延遲固定時間。

綜上所述，對于那些客觀因素造導(dǎo)致延遲固定標(biāo)本，在其延遲時間未達(dá)到48小時之前，并且沒有進(jìn)行免疫組化輔助診斷，可以選用抗原修復(fù)液A、B、C和D進(jìn)行免疫組化檢測。應(yīng)當(dāng)注意的，判定檢測結(jié)果應(yīng)充分考慮到延遲固定帶來的影響。因此，只要通過有效的措施排除了延遲固定產(chǎn)生的不良影響，免疫組化在一定意義上能夠起到輔助診斷的作用。

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免疫組化范文第5篇

[關(guān)鍵詞] 免疫組化; 質(zhì)控; 病理; 醫(yī)技人員; 溝通交流

[中圖分類號] R446.8 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] C [文章編號] 1673-9701(2009)23-121-02

免疫組化是目前病理診斷方面廣泛應(yīng)用的新技術(shù),在病理診斷鑒別腫瘤中起重要作用,也是指導(dǎo)臨床腫瘤治療和判斷腫瘤預(yù)后的重要依據(jù)[1]。免疫組化發(fā)展較快,染色結(jié)果受多種復(fù)雜因素影響以及病理診斷和病理技術(shù)二者均充滿個性化,頗具經(jīng)驗型,難以標(biāo)準(zhǔn)化,造成目前免疫組化質(zhì)量難以令人滿意[2],免疫組化結(jié)果的可靠性,準(zhǔn)確性引起了業(yè)內(nèi)極大的關(guān)注。因此,強(qiáng)化病理實驗室免疫組化質(zhì)控成為當(dāng)前病理學(xué)科發(fā)展的迫切要求[3] 。

1 質(zhì)控中醫(yī)技人員溝通交流的重要性

1.1 對免疫組化質(zhì)控的正確理解是基礎(chǔ)

免疫組化染色結(jié)果受制片因素、染色方法、染色流程、試劑質(zhì)量、實驗室條件等綜合因素影響。同一種抗原可以在多種腫瘤或組織中表達(dá),沒有一種完全針對某一腫瘤或組織的特異性抗體,也給免疫組化染色結(jié)果的正確判斷帶來困難和一定局限性。免疫組化結(jié)果判斷的正確性和可靠性體現(xiàn)病理醫(yī)技人員綜合水平[4]。免疫組化具有非常強(qiáng)的技術(shù)性和實驗性特性決定了要做好免疫組化確實不易。強(qiáng)化免疫組化質(zhì)控,使免疫組化操作逐步規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化、正規(guī)化,對切實提高免疫組化染色質(zhì)量,同時促進(jìn)和提高病理實驗室質(zhì)量管理水平具有很重要的現(xiàn)實意義。

1.2 溝通交流是做好免疫組化質(zhì)控的現(xiàn)實需要

目前,歐美發(fā)達(dá)國家免疫組化質(zhì)控有一套比較先進(jìn)的方法和程序,國內(nèi)免疫組化質(zhì)控方法正處于摸索之中,免疫組化質(zhì)量尚未形成一個權(quán)威性標(biāo)準(zhǔn)。在免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化欠缺足夠重視、免疫組化質(zhì)量參差不齊的狀況下,面對多種復(fù)雜因素影響的免疫組化染色結(jié)果,要做好免疫組化質(zhì)控工作必須依靠病理醫(yī)技人員通力合作。病理醫(yī)生和技術(shù)人員歷來關(guān)系微妙,如果都站在各自立場上,很難客觀正確解讀清楚免疫組化染色結(jié)果現(xiàn)象如染色結(jié)果表達(dá)與不表達(dá),該不該表達(dá)的真正意義和原因,免疫組化染色結(jié)果可靠性將會受到影響。因此,在免疫組化室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)控中非常需要加強(qiáng)彼此之間溝通交流,發(fā)揮診斷醫(yī)生主導(dǎo)作用,改變診斷醫(yī)生只關(guān)心染色結(jié)果、技術(shù)人員只管技術(shù)操作的現(xiàn)狀[5],實事求是綜合分析判斷整個免疫組化制片過程、染色過程、正確評估染色結(jié)果,從而促進(jìn)免疫組化規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化,提高免疫組化病理診斷的質(zhì)量和水平,和諧病理醫(yī)技人員關(guān)系。

2 做好醫(yī)技人員溝通交流的關(guān)鍵

2.1 相互理解和尊重

一般情況下,病理醫(yī)生關(guān)注的只是免疫組化染色結(jié)果,對染色結(jié)果判斷體現(xiàn)醫(yī)生業(yè)務(wù)水平。技術(shù)人員是免疫組化實際操作者,理論水平不足,操作受各種技術(shù)條件因素影響較大。醫(yī)技人員相互之間應(yīng)該尊重,不要各自從專業(yè)技術(shù)解讀染色結(jié)果,應(yīng)該站在對方角度理解各自專業(yè)的能力和局限。大家要充分認(rèn)識到:做好免疫組化質(zhì)控,提高免疫組化質(zhì)量對病理醫(yī)技人員都必須有一個認(rèn)識過程和經(jīng)驗積累過程,正確解讀免疫組化染色結(jié)果也需要有一個不斷認(rèn)識過程,并且這是一個相互促進(jìn)的過程。一些單位開展免疫組化質(zhì)控但效果不明顯,很大程度上是醫(yī)技人員之間的理解和尊重問題以及出現(xiàn)問題后雙方之間缺乏有效的溝通交流。醫(yī)技人員之間相互理解和尊重應(yīng)該是做好免疫組化質(zhì)控的最關(guān)鍵因素,相互之間有效溝通交流是做好免疫組化的現(xiàn)實基礎(chǔ)。

2.2 提高專業(yè)水平

專業(yè)水平不高,難以溝通。免疫組化發(fā)展較快,試劑種類增多、染色方法改進(jìn)、操作流程更新,理論觀念變化都需要病理醫(yī)技人員加強(qiáng)學(xué)習(xí)。專業(yè)素質(zhì)提高了,對染色結(jié)果原因有了客觀理解和正確評估,更有利于病理醫(yī)技人員做好免疫組化質(zhì)控,提高免疫組化質(zhì)量,認(rèn)識免疫組化機(jī)制,有效發(fā)揮免疫組化在病理診斷和指導(dǎo)臨床腫瘤治療中的積極作用,共同推動免疫組化的不斷進(jìn)步和發(fā)展。

3 醫(yī)技人員有效溝通交流的方法和技巧

3.1 建立免疫組化工作單加強(qiáng)室內(nèi)質(zhì)控

免疫組化工作要標(biāo)準(zhǔn)化,需要有嚴(yán)格的質(zhì)量控制。病理醫(yī)技人員要根據(jù)自己實驗室具體情況共同討論制定免疫組化工作單內(nèi)容,將制片程序[6]、試劑類型、染色方法、操作程序、適合的質(zhì)控對照和實驗條件細(xì)化列入室內(nèi)質(zhì)控免疫組化工作單,每次操作中都認(rèn)真實時記錄,客觀反映免疫組化染色全過程,給醫(yī)技人員正確判斷染色結(jié)果,分析結(jié)果原因和總結(jié)經(jīng)驗提供客觀依據(jù)和方向,為盡快找到一種較好的、標(biāo)準(zhǔn)化的免疫組化染色方法,摸索出一種適合本實驗室免疫組化質(zhì)量控制的方法[7]打開思路。避免醫(yī)技人員之間對染色結(jié)果缺乏依據(jù)猜測引發(fā)誤解,營造科室寬松的學(xué)術(shù)氛圍和正常和諧的專業(yè)技術(shù)反饋機(jī)制。在做好免疫組化室內(nèi)質(zhì)控中,摸索最佳抗體和染色流程、最佳實驗室條件以及結(jié)果正確分析和問題原因查找更需要醫(yī)技雙方坦誠交換意見和建議。

3.2 參加全國免疫組化質(zhì)控網(wǎng)活動搞好室間質(zhì)控[8]

全國免疫組化質(zhì)控網(wǎng)通過病理專家和試劑公司技術(shù)專家對統(tǒng)一分發(fā)切片的染色效果按照免疫組化質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)測評,找出普遍存在問題,提出改進(jìn)意見,推薦最佳抗體和染色流程,為免疫組化染色規(guī)范化起到了很好的促進(jìn)作用,參加的單位都得到較大提高。爭取參與其中室間質(zhì)控活動,了解專家對本單位免疫組化染色結(jié)果的評估,分析本單位與優(yōu)秀實驗室的質(zhì)量差異,病理醫(yī)技人員可以明確知道本單位免疫組化染色結(jié)果真實情況,找到準(zhǔn)確解讀染色結(jié)果的方法,在較高技術(shù)層次對比中找差距,分析原因,學(xué)習(xí)和借鑒國內(nèi)外好方法好經(jīng)驗,不斷改進(jìn)操作提高免疫組化質(zhì)量。這些無論對診斷醫(yī)生還是技術(shù)人員在免疫組化規(guī)范化學(xué)習(xí)方面都是最便捷、提高最快、效果最明顯的好方法。

病理醫(yī)技人員之間相互溝通交流是打開免疫組化質(zhì)控的一扇窗戶,效果取決于病理醫(yī)技人員共同努力,效應(yīng)體現(xiàn)在免疫組化質(zhì)量上。

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