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生物質(zhì)譜技術(shù)與方法范文第1篇

關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)，質(zhì)譜分析，應(yīng)用

前言：

蛋白質(zhì)是生物體中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物細(xì)胞，約占細(xì)胞干質(zhì)量的50%以上，作為生命的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，蛋白質(zhì)在催化生命體內(nèi)各種反應(yīng)進(jìn)行、調(diào)節(jié)代謝、抵御外來物質(zhì)入侵及控制遺傳信息等方面都起著至關(guān)重要的作用，因此蛋白質(zhì)也是生命科學(xué)中極為重要的研究對象。關(guān)于蛋白質(zhì)的分析研究，一直是化學(xué)家及生物學(xué)家極為關(guān)注的問題，其研究的內(nèi)容主要包括分子量測定，氨基酸鑒定，蛋白質(zhì)序列分析及立體化學(xué)分析等。隨著生命科學(xué)的發(fā)展，儀器分析手段的更新，尤其是質(zhì)譜分析技術(shù)的不斷成熟，使這一領(lǐng)域的研究發(fā)展迅速。

自約翰.芬恩(JohnB.Fenn)和田中耕一(Koichi.Tanaka)發(fā)明了對生物大分子進(jìn)行確認(rèn)和結(jié)構(gòu)分析的方法及發(fā)明了對生物大分子的質(zhì)譜分析法以來，隨著生命科學(xué)及生物技術(shù)的迅速發(fā)展，生物質(zhì)譜目前已成為有機(jī)質(zhì)譜中最活躍、最富生命力的前沿研究領(lǐng)域之一[1]。它的發(fā)展強(qiáng)有力地推動了人類基因組計(jì)劃及其后基因組計(jì)劃的提前完成和有力實(shí)施。質(zhì)譜法已成為研究生物大分子特別是蛋白質(zhì)研究的主要支撐技術(shù)之一，在對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的研究中占據(jù)了重要地位[2]。

1．質(zhì)譜分析的特點(diǎn)

質(zhì)譜分析用于蛋白質(zhì)等生物活性分子的研究具有如下優(yōu)點(diǎn)：很高的靈敏度能為亞微克級試樣提供信息，能最有效地與色譜聯(lián)用，適用于復(fù)雜體系中痕量物質(zhì)的鑒定或結(jié)構(gòu)測定，同時具有準(zhǔn)確性、易操作性、快速性及很好的普適性。

2．質(zhì)譜分析的方法

近年來涌現(xiàn)出較成功地用于生物大分子質(zhì)譜分析的軟電離技術(shù)主要有下列幾種：1)電噴霧電離質(zhì)譜；2)基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜；3)快原子轟擊質(zhì)譜；4)離子噴霧電離質(zhì)譜；5)大氣壓電離質(zhì)譜。在這些軟電離技術(shù)中，以前面三種近年來研究得最多，應(yīng)用得也最廣泛[3]。

3．蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析

蛋自質(zhì)是一條或多條肽鏈以特殊方式組合的生物大分子，復(fù)雜結(jié)構(gòu)主要包括以肽鏈為基礎(chǔ)的肽鏈線型序列[稱為一級結(jié)構(gòu)]及由肽鏈卷曲折疊而形成三維[稱為二級，三級或四級]結(jié)構(gòu)。目前質(zhì)譜主要測定蛋自質(zhì)一級結(jié)構(gòu)包括分子量、肽鏈氨基酸排序及多肽或二硫鍵數(shù)目和位置。

3.1蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析原理

以往質(zhì)譜(MS)僅用于小分子揮發(fā)物質(zhì)的分析，由于新的離子化技術(shù)的出現(xiàn)，如介質(zhì)輔助的激光解析/離子化、電噴霧離子化，各種新的質(zhì)譜技術(shù)開始用于生物大分子的分析。其原理是：通過電離源將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為氣相離子，然后利用質(zhì)譜分析儀的電場、磁場將具有特定質(zhì)量與電荷比值(M/Z值)的蛋白質(zhì)離子分離開來，經(jīng)過離子檢測器收集分離的離子，確定離子的M/Z值，分析鑒定未知蛋白質(zhì)。

3.2蛋白質(zhì)和肽的序列分析

現(xiàn)代研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)越來越多的小肽同蛋白質(zhì)一樣具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽庫是現(xiàn)在的研究熱點(diǎn)之一。因此需要高效率、高靈敏度的肽和蛋白質(zhì)序列測定方法支持這些研究的進(jìn)行?，F(xiàn)有的肽和蛋白質(zhì)測序方法包括N末端序列測定的化學(xué)方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化學(xué)降解法等，這些方法都存在一些缺陷。例如作為肽和蛋白質(zhì)序列測定標(biāo)準(zhǔn)方法的N末端氨基酸苯異硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法，又稱PTH法)，測序速度較慢(50個氨基酸殘基/天)；樣品用量較大(nmol級或幾十pmol級)；對樣品純度要求很高；對于修飾氨基酸殘基往往會錯誤識別，而對N末端保護(hù)的肽鏈則無法測序[4]。C末端化學(xué)降解測序法則由于無法找到PITC這樣理想的化學(xué)探針，其發(fā)展仍面臨著很大的困難。在這種背景下，質(zhì)譜由于很高的靈敏度、準(zhǔn)確性、易操作性、快速性及很好的普適性而倍受科學(xué)家的廣泛注意。在質(zhì)譜測序中，靈敏度及準(zhǔn)確性隨分子量增大有明顯降低，所以肽的序列分析比蛋白容易許多，許多研究也都是以肽作為分析對象進(jìn)行的。近年來隨著電噴霧電離質(zhì)譜(electrosprayionisation，ESI)及基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜(matrixassistedlaserdesorption/ionization，MALDI)等質(zhì)譜軟電離技術(shù)的發(fā)展與完善，極性肽分子的分析成為可能，檢測限下降到fmol級別，可測定分子量范圍則高達(dá)100000Da，目前基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法(MALDITOFMS)已成為測定生物大分子尤其是蛋白質(zhì)、多肽分子量和一級結(jié)構(gòu)的有效工具，也是當(dāng)今生命科學(xué)領(lǐng)域中重大課題——蛋白質(zhì)組研究所必不可缺的關(guān)鍵技術(shù)之一[5]。目前在歐洲分子生物實(shí)驗(yàn)室(EMBL)及美國、瑞士等國的一些高校已建立了MALDITOFMS蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)(序列)譜庫，能為解析FAST譜圖提供極大的幫助，并為確證分析結(jié)果提供可靠的依據(jù)[6]。3蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析方式

質(zhì)譜用于肽和蛋白質(zhì)的序列測定主要可以分為三種方法：一種方法叫蛋白圖譜(proteinmapping)，即用特異性的酶解或化學(xué)水解的方法將蛋白切成小的片段，然后用質(zhì)譜檢測各產(chǎn)物肽分子量，將所得到的肽譜數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)庫，搜索與之相對應(yīng)的已知蛋白，從而獲取待測蛋白序列。將蛋白質(zhì)繪制“肽圖”是一重要測列方法。第二種方法是利用待測分子在電離及飛行過程中產(chǎn)生的亞穩(wěn)離子，通過分析相鄰?fù)M類型峰的質(zhì)量差，識別相應(yīng)的氨基酸殘基，其中亞穩(wěn)離子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用誘導(dǎo)碎裂.第三種方法與Edman法有相似之處，即用化學(xué)探針或酶解使蛋白或肽從N端或C端逐一降解下氨基酸殘基，形成相互間差一個氨基酸殘基的系列肽，名為梯狀測序(laddersequencing)，經(jīng)質(zhì)譜檢測，由相鄰峰的質(zhì)量差知道相應(yīng)氨基酸殘基。

3.3.1蛋白消化

蛋白的基團(tuán)越大，質(zhì)譜檢測的準(zhǔn)確率越低。因此，在質(zhì)譜檢測之前，須將蛋白消化成小分子的多肽，以提高質(zhì)譜檢測的準(zhǔn)確率。一般而言，6-20個氨基酸的多肽最適合質(zhì)譜儀的檢測?，F(xiàn)今最常用的酶為胰蛋白酶(trypsin)，它于蛋白的賴氨酸(lysine)和精氨酸(arginine)處將其切斷。因此，同一蛋白經(jīng)胰蛋白酶消化后，會產(chǎn)生相同的多肽。

3.3.2基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時間質(zhì)譜測量法(MALDI-TOFMS)[7]

簡而言之，基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時間質(zhì)譜測量儀是將多肽成分轉(zhuǎn)換成離子信號，并依據(jù)質(zhì)量/電荷之比(mass/charge，m/z)來對該多肽進(jìn)行分析，以判斷該多肽源自哪一個蛋白。待檢樣品與含有在特定波長下吸光的發(fā)光團(tuán)的化學(xué)基質(zhì)(matrix)混合，此樣品混合物隨即滴于一平板或載玻片上進(jìn)行揮發(fā)，樣品混合物殘余水份和溶劑的揮發(fā)使樣品整合于格狀晶體中，樣品然后置于激光離子發(fā)生器(lasersource)。激光作用于樣品混合物，使化學(xué)基質(zhì)吸收光子而被激活。此激活產(chǎn)生的能量作用于多肽，使之由固態(tài)樣品混合物變成氣態(tài)。由于多肽分子傾向于吸收單一光子，故多肽離子帶單一電荷.這些形成的多肽離子直接進(jìn)入飛行時間質(zhì)量分析儀(TOFmassanalyzer)。飛行時間質(zhì)量分析儀用于測量多肽離子由分析儀的一端飛抵另一端探測器所需要的時間。而此飛行時間同多肽離子的質(zhì)量/電荷的比值成反比，即質(zhì)量/電荷之比越高，飛行時間越短。最后，由電腦軟件將探測器錄得的多肽質(zhì)量/電荷比值同數(shù)據(jù)庫中不同蛋白經(jīng)蛋白酶消化后所形成的特定多肽的質(zhì)量/電荷比值進(jìn)行比較，以鑒定該多肽源自何種蛋白.此法稱為多肽質(zhì)量指紋分析(peptidemassfin-gerprinting)。基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時間質(zhì)譜測量法操作簡便，敏感度高，同許多蛋白分離方法相匹配，而且，現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中有充足的關(guān)于多肽質(zhì)量/電荷比值的數(shù)據(jù)，因此成為許多實(shí)驗(yàn)室的首選蛋白質(zhì)譜鑒定方法。

3.3.3電子噴霧電離質(zhì)譜測量法(electrosprayion-izationmassspectrometry,ESI-MS)[8]

同基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時間質(zhì)譜測量法在固態(tài)下完成不同，電子噴霧電離質(zhì)譜測量法是在液態(tài)下完成，而且多肽離子帶有多個電荷，由高效液相層析等方法分離的液體多肽混合物，在高壓下經(jīng)過一細(xì)針孔。當(dāng)樣本由針孔射出時，噴射成霧狀的細(xì)小液滴，這些細(xì)小液滴包含多肽離子及水份等其他雜質(zhì)成分。去除這些雜質(zhì)成分后，多肽離子進(jìn)入連續(xù)質(zhì)量分析儀(tan-demmassanalyzer)，連續(xù)質(zhì)量分析儀選取某一特定質(zhì)量/電荷比值的多肽離子，并以碰撞解離的方式將多肽離子碎裂成不同電離或非電離片段。隨后，依質(zhì)量/電荷比值對電離片段進(jìn)行分析并匯集成離子譜(ionspectrum)，通過數(shù)據(jù)庫檢索，由這些離子譜得到該多肽的氨基酸序列。依據(jù)氨基酸序列進(jìn)行的蛋白鑒定較依據(jù)多肽質(zhì)量指紋進(jìn)行的蛋白鑒定更準(zhǔn)確、可靠。而且，氨基酸序列信息即可通過蛋白氨基酸序列數(shù)據(jù)庫檢索，也可通過核糖核酸數(shù)據(jù)庫檢索來進(jìn)行蛋白鑒定。4．蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的應(yīng)用

1981年首先采用FAB雙聚焦質(zhì)譜測定肽分子量，分析十一肽(Mr=1318)，質(zhì)譜中出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子[M+1]+=1319強(qiáng)峰。分子量小于6kDa肽或小蛋白質(zhì)合適用FAB質(zhì)譜分析，更大分子量的多肽和蛋自質(zhì)可用MALDI質(zhì)譜或ESI質(zhì)譜分析。用MALDI-TOF質(zhì)譜分析蛋自質(zhì)最早一例是HillenKramp等[9]于1988年提出用紫外激光以煙酸為基質(zhì)在TOF譜儀上測出質(zhì)量數(shù)高達(dá)60kDa蛋白質(zhì)，精確度開始只有0.5%，后改進(jìn)到0.1-0.2%。質(zhì)譜技術(shù)主要用于檢測雙向凝膠電泳或“雙向”高效柱層析分離所得的蛋白質(zhì)及酶解所得的多肽的質(zhì)量，也可用于蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)間相互作用等方面的研究[10,11],三條肽段的精確質(zhì)量數(shù)便可鑒定蛋白質(zhì)。近年來，串聯(lián)質(zhì)譜分析儀發(fā)展迅猛，其數(shù)據(jù)采集方面的自動化程度、檢測的敏感性及效率都大大提高，大規(guī)模數(shù)據(jù)庫和一些分析軟件(如:SEQUEST)的應(yīng)用使得串聯(lián)質(zhì)譜分析儀可以進(jìn)行更大規(guī)模的測序工作。目前，利用2D電泳及MS技術(shù)對整個酵母細(xì)胞裂解產(chǎn)物進(jìn)行分析，已經(jīng)鑒定出1484種蛋白質(zhì)，包括完整的膜蛋白和低豐度的蛋白質(zhì)[12]；分析肝細(xì)胞癌患者血清蛋白質(zhì)組成分[13]，并利用質(zhì)譜進(jìn)行鑒定磷酸化蛋白研究工作[14]及采用質(zhì)譜技術(shù)研究許旺細(xì)胞源神經(jīng)營養(yǎng)蛋白(SDNP)的分子結(jié)構(gòu)[15]等。

結(jié)束語：

在蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析中，質(zhì)譜的準(zhǔn)確性(accuracy)對測定結(jié)果有很大影響，因此質(zhì)譜測序現(xiàn)在仍很難被應(yīng)用于未知蛋白的序列測定。肽和蛋白的質(zhì)譜序列測定方法具有快速、用量少、易操作等優(yōu)點(diǎn)，這些都非常適合于現(xiàn)在科學(xué)研究的需要。我們相信，隨著各種衍生化方法和酶解方法的不斷改進(jìn)，蛋白雙向電泳的應(yīng)用[16]以及質(zhì)譜技術(shù)的不斷完善，質(zhì)譜將會成為多肽和蛋白質(zhì)分析最有威力的工具之一。

參考文獻(xiàn)

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8．HarveyDJ.Identificationofprotein-boundcarbohydratesbymassspectrometry[J].Proteomic,2001;1(2):311-328.

9．KARASM,HILLENKAMPF.Laserdesorptionionizationofproteinswithmolecularmassesexceeding10000daltons[J].Anal.Chem,1988,60:2299-2301.

生物質(zhì)譜技術(shù)與方法范文第2篇

    研究中藥的作用機(jī)制必須清楚中藥作用后的物質(zhì)變化,生物質(zhì)譜可以用來對中藥作用后的相關(guān)蛋白等大分子物質(zhì)進(jìn)行分析。劉鵬等[v]采用腹腔注射內(nèi)毒素(LPS)復(fù)制內(nèi)毒素肝損傷模型,清熱解毒涼血化疲中藥干預(yù),用SELDI-TOF一MS技術(shù)分析大鼠血清差異表達(dá)蛋白,共獲得與芯片結(jié)合的11個有效蛋白質(zhì)峰,各組大鼠的血清內(nèi)存在的差異表達(dá)蛋白,有助于內(nèi)毒素肝損傷的進(jìn)一步研究。此項(xiàng)工作需更進(jìn)一步對產(chǎn)生差異的蛋白進(jìn)行鑒定,才可揭示此類蛋白在中藥干預(yù)機(jī)制中的意義或作用。

    2中藥與生物大分子的相互作用

    研究中藥化學(xué)成分與生物大分子的相互作用可以找到中藥與靶分子的作用機(jī)制,進(jìn)一步闡明中藥的作用機(jī)制。生物質(zhì)譜的軟電離技術(shù)可以測得中藥小分子與蛋白等大分子相互作用的化學(xué)計(jì)量比,計(jì)算二者之間的結(jié)合強(qiáng)度、確定藥物的結(jié)合位點(diǎn)以及獲得反應(yīng)動力學(xué)等多方面的信息。主要有兩種思路:(1)通過測定復(fù)合物的相對豐度比較中藥小分子與蛋白等大分子的相對作用強(qiáng)度;(2)通過比較中藥小分子藥物濃度加人蛋白等大分子前后的變化來推斷兩者的相對作用強(qiáng)度,目前,已應(yīng)用生物質(zhì)譜測定中藥小分子與核酸如DNA、蛋白或多膚等大分子之間相互作用的研究[8]。例如,zhangH等[9]利用Esl一Ms研究了人參皂昔與細(xì)胞色素C之間的相互作用,獲得K(D)值。鄭州大學(xué)陳曉嵐等[l0一,’]對一些磷酞化修飾的黃酮類中藥與溶菌酶和。一乳白蛋白之間的相互作用進(jìn)行了研究,計(jì)算出結(jié)合常數(shù),推算出兩者的結(jié)合力類型。盡管生物質(zhì)譜為中藥小分子與生物大分子之間的相互作用提供了很好的研究手段,但應(yīng)該看到,由于中藥的復(fù)雜性以及研究環(huán)境與體內(nèi)有很大的差異,許多研究結(jié)果還需要體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。

    3中藥治療的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

    蛋白質(zhì)組學(xué)是近年醫(yī)藥和生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。蛋白質(zhì)組學(xué)的含義是:一個基因組、一種生物或一種細(xì)胞/組織所表達(dá)的全套蛋白。蛋白質(zhì)組學(xué)的核心在于大規(guī)模地對蛋白質(zhì)進(jìn)行綜合分析,通過對某種物種、個體、器官、組織或細(xì)胞的全部蛋白質(zhì)性質(zhì)(包括表達(dá)水平、結(jié)構(gòu)、翻譯后修飾、細(xì)胞內(nèi)定位、蛋白質(zhì)相互作用等)的研究,對蛋白質(zhì)所執(zhí)行的生理性、病理性生命活動做出最精細(xì)、最準(zhǔn)確、最本質(zhì)的闡述[,2]。中藥治療的蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基本研究思路是,首先造模,確定造模成功后提取總蛋白質(zhì),2一DE電泳技術(shù)分離總蛋白建立蛋白質(zhì)組圖譜,用圖像分析軟件尋找模型組、對照組及中藥治療組各組間差異蛋白點(diǎn),MALDI一TOF/MS分析差異蛋白點(diǎn),并結(jié)合蛋白質(zhì)生物信息庫,初步鑒定差異蛋白質(zhì)。在此方面國內(nèi)學(xué)者進(jìn)行了一些探索[ls一l#],有學(xué)者研究了單體人參皂昔對人肺巨細(xì)胞癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株蛋白質(zhì)組的表達(dá)的影響,還有報(bào)道研究松果菊昔對小鼠帕金森病模型黑質(zhì)紋狀體組織蛋白表達(dá)的影響,再如研究中藥復(fù)方強(qiáng)骨寶1號對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠皮質(zhì)骨蛋白質(zhì)組表達(dá)的影響等。以上研究結(jié)果找到一些差異蛋白,為中藥作用機(jī)制的研究提供了依據(jù)。

    4代謝組學(xué)研究

生物質(zhì)譜技術(shù)與方法范文第3篇

[關(guān)鍵詞] 超濾質(zhì)譜；板藍(lán)根；活性成分；神經(jīng)氨酸酶抑制活性

[收稿日期] 2013-11-17

[基金項(xiàng)目] 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （81274078， 81322052， 81303222）

[通信作者] *鄢丹，Tel/Fax：（010）66933325，E-mail： ；*肖小河，E-mail：

板藍(lán)根Isatidis Radix為臨床常用中藥，主要用于治療上呼吸道感染等疾病，療效確切，一般認(rèn)為與其抗流感病毒藥理活性相關(guān)[1-4]。由于板藍(lán)根化學(xué)成分復(fù)雜，藥效物質(zhì)尚不明確，影響了其質(zhì)量評控水平的提升及臨床療效的穩(wěn)定發(fā)揮?，F(xiàn)行藥效物質(zhì)篩選模式（植化分離、藥理活性示蹤、血清藥物化學(xué)篩選等）在推動中藥藥效物質(zhì)發(fā)現(xiàn)的同時，操作繁瑣、活性成分易丟失等局限也日益顯現(xiàn)[5-7]。因此，有必要探索高通量、靈敏的中藥藥效物質(zhì)發(fā)現(xiàn)新技術(shù)。

超濾質(zhì)譜技術(shù)是將超濾裝置與質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合后形成的一種新方法，主要是利用親和原理，將含有潛在活性的小分子物質(zhì)與受體（靶部位如蛋白或酶等）混合，形成受體-配體復(fù)合物（采用超濾薄膜除去可能含有的未結(jié)合小分子），以有機(jī)溶劑處理并釋放小分子配體，進(jìn)一步采用液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對其進(jìn)行鑒定，從而實(shí)現(xiàn)活性成分的快速初篩[8]。目前，該技術(shù)在先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)、配體與受體結(jié)合強(qiáng)度以及相關(guān)機(jī)制等研究方面有較廣泛的應(yīng)用[9-14]。

神經(jīng)氨酸酶作為抗流感病毒藥物的主要作用靶點(diǎn)之一，可協(xié)助成熟流感病毒脫離宿主細(xì)胞感染新的細(xì)胞[15]。板藍(lán)根具有神經(jīng)氨酸酶抑制活性[16-17]，本研究借助超濾質(zhì)譜技術(shù)篩選板藍(lán)根與神經(jīng)氨酸酶結(jié)合的潛在活性成分，同時配以神經(jīng)氨酸酶體外活性評價，以期發(fā)現(xiàn)板藍(lán)根抗流感病毒可能的藥效成分，將為板藍(lán)根質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升以及中藥藥效物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)提供技術(shù)參考。

1 材料

Waters 2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Waters Xevo G2 Qtof質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；自動酶標(biāo)儀（美國bio-tek公司）；超速離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；板藍(lán)根購自安徽，經(jīng)中國人民第302醫(yī)院中藥研究所肖小河研究員鑒定為十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigotica Fort. 的干燥根；精氨酸（arginine），告依春（goitrin），腺苷（adenosinea）對照品購自中國食品藥品檢定研究院；2-（N-嗎啡啉）-乙磺酸（MES）購自sigma公司，神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase， NA）（human H1N1）購自Sino biological公司；YM-100 超濾膜購自Millipore 公司；神經(jīng)氨酸酶熒光底物2′-（4-methylumbelliferyl）-D-N-acetylneuraminic acid （MUNANA），奧斯他韋酸（Oseltamivir acid）購自Toronto Research Chemicals Lnc.；甘氨酸購自北京索萊寶科技公司。甲醇和乙酸均為色譜純（美國Fisher公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 樣品制備

2.1.1 供試品溶液制備 取板藍(lán)根藥材粉末（過3號篩）約5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加水50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放至室溫，加水補(bǔ)足質(zhì)量，濾過；取續(xù)濾液25 mL，濃縮至15 mL，放冷，加乙醇20 mL，靜置使沉淀，離心，過濾；另取60%乙醇10 mL洗滌沉淀過濾器，合并上清液及濾液，濃縮至近干，加水溶解定容于5 mL量瓶中，過0.22 μm微孔濾膜，樣品用于超濾實(shí)驗(yàn)和體外酶活性實(shí)驗(yàn)分析。

2.1.2 對照品溶液制備 告依春對照品用甲醇配成質(zhì)量濃度為2 g·L-1的儲備液；精氨酸對照品用甲醇配成質(zhì)量濃度為10 g·L-1的儲備液；腺苷對照品用甲醇配成質(zhì)量濃度為10 g·L-1的儲備液。

2.1.3 參照物溶液制備 取奧司他韋酸適量，精密稱定，加水制成每1 mL含50 ng的溶液，按等比級數(shù)1∶0.5稀釋成4個不同濃度的參照物溶液。

2.1.4 緩沖液制備 稱取MES 0.64 g， CaCl2 0.044 g溶于100 mL 超純水中，配成濃度為32.5 mmol·L-1 MES，4 mmol·L-1CaCl2的緩沖溶液，并用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.5。

2.1.5 終止液制備 取甘氨酸1.5 g，加25%乙醇溶解，氫氧化鈉試液調(diào)pH至10.7，即得。

2.2 色譜與質(zhì)譜條件

2.2.1 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm， 1.7 μm），柱溫25 ℃，流速0.4 mL·min-1。流動相水（A）-甲醇（B）二元梯度洗脫，具體梯度為0～3 min，95%～50% A；3～10 min，50%～30% A；10～15 min，30%～0% A；15～18 min，0%～0% A；18～21 min，95%～95% A。

2.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），采用正離子掃描檢測；脫溶劑氣流量800 L·h-1，脫溶劑溫度350 ℃，錐孔氣流量50 L·h-1，離子源溫度120 ℃，毛細(xì)管電壓正離子掃描3 200 V，負(fù)離子掃描2 700 V，錐孔電壓35 V，微通道板電壓3 500 V，碰撞能6 V，碰撞氣氬氣，碰撞室壓力小于0.28 Pa。質(zhì)譜掃描范圍50～1 200。

2.3 超濾實(shí)驗(yàn)

分別吸取一定量板藍(lán)根提取物溶液和神經(jīng)氨酸酶溶液加至pH 6.5的緩沖溶液中，隨后置37 ℃水浴中反應(yīng)30 min后，吸取一定量轉(zhuǎn)移至截留相對分子質(zhì)量為100的YM-100 型超濾管中，8 500 r·min-1離心5 min，濾膜加緩沖溶液（pH 6.5）離心清洗3次，洗去未結(jié)合成分。再向?yàn)V膜中加入適量的50%甲醇，8 500 r·min-1離心7 min 釋放結(jié)合配體，重復(fù)3次，收集洗脫液，冷凍干燥后加50%甲醇500 μL溶解，用于LC-MS分析。為了排除由于超濾膜對小分子的吸附作用而產(chǎn)生的假陽性結(jié)果，每次實(shí)驗(yàn)前均進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)，即同法處理不加NA的藥材溶液[17]。

2.4 神經(jīng)氨酸酶活性實(shí)驗(yàn)

采用課題組已建立的神經(jīng)氨酸酶（NA）活性檢測法[16，18]表征藥物抗流感病毒的作用強(qiáng)度。反應(yīng)在96孔板熒光酶標(biāo)板中進(jìn)行，首先加入稀釋的神經(jīng)氨酸酶25 μL和供試品溶液25 μL，室溫下作用30 min后加底物MUNANA 50 μL 37 ℃孵育60 min后加入終止液MES（0.1 mol·L-1甘氨酸，以25%乙醇配制，10%氫氧化鈉溶液調(diào)pH 10.7）200 μL終止反應(yīng)。測定熒光強(qiáng)度值，設(shè)置激發(fā)波長355 nm，發(fā)射波長460 nm，檢測溫度37 ℃。為便于活性比較，同時設(shè)樣品測試組（NA + 樣品 + MUNANA），背景對照組（樣品+ MUNANA，緩沖液補(bǔ)足至相同體積），空白熒光組（MUNANA，用緩沖液和樣品溶劑補(bǔ)充至相同體積），酶活性對照組（NA + MUNANA，反應(yīng)終止后再加入同體積樣品溶液），每組設(shè)6個復(fù)孔。

3 結(jié)果

3.1 超濾質(zhì)譜篩選抑制神經(jīng)氨酸酶活性成分

采用超濾質(zhì)譜技術(shù)，通過比較對照組（超濾不加酶）、對照品組、藥材原液組（不超濾不加酶）和實(shí)驗(yàn)組（超濾加酶）中成分的差異，并結(jié)合基峰總離子流色譜圖（圖1）和提取離子流色譜圖（圖2）篩選與神經(jīng)氨酸酶有相互作用的成分，結(jié)果共篩選鑒定出3個可與NA結(jié)合的化合物，分別為精氨酸、告依春和腺苷。在本實(shí)驗(yàn)條件下，實(shí)驗(yàn)組（超濾加酶）色譜圖主要集中在4 min內(nèi)。

由圖2可知，板藍(lán)根藥材提取離子流圖中精氨酸、告依春、腺苷的保留時間分別為0.344，0.455，0.491 min。Q-TOF-MS給出的準(zhǔn)分子離子峰分別為精氨酸m/z 175.119 0，告依春m/z 130.033 2，腺苷m/z 268.104 6，分別與對照品精氨酸、告依春、腺苷比對，具有相同的保留時間、準(zhǔn)分子離子峰，由此可以確認(rèn)上述3種化合物分別為精氨酸、告依春、腺

A. 對照組（未加酶組）；B. 對照品組；C. 板藍(lán)根藥液組；D. 實(shí)驗(yàn)組（加酶組）。

圖1 不同組別樣品總離子流圖

Fig.1 The total ion chromatogram of different groups

苷。對照組和實(shí)驗(yàn)組中化合物亦按照上述方法進(jìn)行確認(rèn)。

由于色譜峰的積分面積與其相應(yīng)的濃度成正比，故可以通過超濾前后色譜峰積分面積的變化程度來反映相應(yīng)化合物與生物靶分子的結(jié)合程度。按如下公式進(jìn)行計(jì)算[20]：結(jié)合率=（Ae-Ac）/A×100%，其中A為藥物原液色譜峰的積分面積，Ae為實(shí)驗(yàn)組色譜峰的積分面積，Ac為對照組色譜峰的積分面積。

利用這種計(jì)算方法對板藍(lán)根藥材中各組分與靶分子的相對結(jié)合強(qiáng)度進(jìn)行計(jì)算，3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示精氨酸、告依春、腺苷的結(jié)合常數(shù)分別為（36.23±1.12）%，（32.54±1.02）%，（9.38±0.47）%（精氨酸>告依春>腺苷）。比較結(jié)合常數(shù)可以看出，精氨酸和告依春與神經(jīng)氨酸酶的結(jié)合強(qiáng)度較大，提示精氨酸和告依春可能是板藍(lán)根抑制神經(jīng)氨酸酶的活性成分。

a. 對照組（未加酶）； b. 板藍(lán)根藥液組； c. 實(shí)驗(yàn)組（加酶組）；1.精氨酸；2.告依春；3.腺苷。

圖2 不同成分提取離子色譜圖

Fig.2 The extracted ion chromatogram of different compound

3.2 體外神經(jīng)氨酸酶抑制活性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

采用體外神經(jīng)氨酸酶活性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證超濾質(zhì)譜初篩實(shí)驗(yàn)結(jié)果（以NA為陽性藥），結(jié)果表明，精氨酸、告依春和腺苷超濾質(zhì)譜的結(jié)合常數(shù)與體外神經(jīng)氨酸酶活性檢測結(jié)果吻合度良好，提示超濾質(zhì)譜技術(shù)在初篩中藥活性成分具有高通量、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)勢（圖3）。

4 討論與結(jié)論

本研究借助超濾質(zhì)譜技術(shù)，通過比對不同組別板藍(lán)根樣品超濾前后成分的變化情況，篩選并鑒定出精氨酸、告依春與神經(jīng)氨酸酶結(jié)合能力顯著；進(jìn)一步以體外神經(jīng)氨酸酶活性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)精氨酸和告依春可能是板藍(lán)根抗流感病毒的活性成分，為板藍(lán)根質(zhì)量評價指標(biāo)的選擇提供了科學(xué)依據(jù)，有助于

*腺苷IC50大于500 g·L-1。

圖3 初篩成分超濾質(zhì)譜結(jié)合常數(shù)與體外活性IC50對比圖（n=3）

Fig.3 Comparison of binding degree and IC50of the screening compounds against neuraminidase（n=3）

其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升。

與藥效成分常規(guī)篩選方法相比，超濾質(zhì)譜技術(shù)是基于對藥物小分子與其活性發(fā)揮關(guān)鍵靶點(diǎn)（蛋白、酶等）相互作用的共識而建立的中藥活性成分初篩技術(shù)，具有高通量、靈敏、快速等技術(shù)優(yōu)勢，適合用于活性成分的早期篩選、活性強(qiáng)度評測以及相關(guān)機(jī)制初步探索研究。同時，結(jié)合中藥多成分、多靶點(diǎn)作用特點(diǎn)，深入開展不同關(guān)鍵靶點(diǎn)和體內(nèi)試驗(yàn)以確認(rèn)初篩的活性成分將是十分重要而有意義的研究工作。

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Screening bioactive compounds inhibiting influenza virus from Isatidis

Radix by ultrafiltration mass spectrometry

MA Li-na ZHANG Cong-en， YAN Dan， TAN Man-rong， LI Han-bing， ZHANG Le-le， XIONG Yin， XIAO Xiao-he

（1.College of Pharmacy， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 610075， China；

2. China Military Institute of Chinese Materia Medica， 302 Military Hospital， Beijing 100039， China；

3.College of Pharmacy， He′nan University of Traditional Chinese Medicine， Zhengzhou 450008， China）

[Abstract] In vitro neuraminidase inhibition assays and ultrafiltration liquid chromatography with diodearray detector coupled to time of flight mass spectrometer （UPLC-DAD-TOF-MS） were combined to screen bioactive compounds inhibiting neuraminidase from Isatidis Radix. By comparing the compounds from Isatidis Radix before and after ultrafiltration， we found that arginine， goitrin and adenosinea can bind with neuraminidase， and the binding degree of the three compounds were （36.23±1.12）%， （32.54±1.02）% and （9.38±0.47）%， respectively. The IC50of arginine and goitrin were （1.16±0.02）， （1.20±0.02） g·L-1， respectively. While the IC50of adenosinea was higher than 500 g·L-1. The results showed that arginine and goitrin might be the main compounds with antiviral activity of Isatidis Radix. This study may provide a useful method for the screening of bioactive compounds and quality control of Isatidis Radix.

生物質(zhì)譜技術(shù)與方法范文第4篇

【摘要】 目的對8種化濕藥揮發(fā)油成分進(jìn)行定性、定量分析，并比較揮發(fā)性成分的異同。方法在運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)技術(shù)的基礎(chǔ)上采用HELP（直觀推導(dǎo)式演進(jìn)特征投影法）對產(chǎn)生的二維色譜-質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行解析，對組分進(jìn)行定性和相對定量分析。結(jié)果鑒定出相對共有成分達(dá)60余種，8種藥材揮發(fā)性成分中均含有桉葉油醇(Eucalyptol，0.01%～82.41%)和環(huán)氧石竹烯(Caryophyllene oxide，0.02%～5.5%)。結(jié)論8種化濕藥揮發(fā)油共有成分大多數(shù)為萜類化合物及其衍生物，但其含量存在較大差異。

【關(guān)鍵詞】 揮發(fā)油; 氣相色譜-質(zhì)譜; 直觀推導(dǎo)式演進(jìn)特征投影法

Abstract:ObjectiveTo detect chemical components of the volatile oil in eight samples of damp dispersing herbs. MethodsGas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) with heuristic latent projections (HELP) method， and overall volume integration method were used. ResultsMore than 60 relatively common components were identified. Eucalyptol(relative content tr～82.41%) and Caryophyllene oxide（0.02%～5.5%） are the common main compounds of the eight plants. ConclusionThere is a lot differences in the chemical compounds among the eight damp dispersing herbs， Terpenes and their derivatives are the main components， and also in percentages on many levels.

Key words:Volatile oil; GC/MS; Heuristic Evolving Latent Projection (HELP)

凡功能化除濕濁，醒悅脾胃的藥物，稱為化濕藥(damp dispersing herbs)?；瘽袼帲?］大多氣味芳香，故又稱為“芳香化濕藥”。化濕藥主要適用于濕困脾胃、身體倦怠、脘腹脹悶等癥。此外，對濕溫、暑溫諸癥亦有治療作用。本文選取了常用的8種化濕藥如藿香、草果、蒼術(shù)、佩蘭、厚樸、白豆蔻、草豆蔻、砂仁，采用水蒸氣蒸餾法分別提取揮發(fā)油，利用氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)檢測，運(yùn)用（直觀推導(dǎo)式演進(jìn)特征投影法）(HELP)方法對產(chǎn)生的二維色譜-質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行解析，得到各組分的純色譜曲線和質(zhì)譜，根據(jù)其保留時間和質(zhì)譜，在質(zhì)譜庫中進(jìn)行檢索，對組分進(jìn)行定性和相對定量分析。

1 儀器與藥品

儀器為日本島津QP2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(檢索用NIST107版質(zhì)譜庫)。8種藥品均購于湖南長沙市老百姓大藥房，均經(jīng)過劉韶副教授鑒定。

2 方法

2.1 揮發(fā)性成分的提取取原藥材樣品各40 g，粉碎后按以上順序編號為A1至A8備用。根據(jù)《中國藥典》（2005年版）［2］中的標(biāo)準(zhǔn)方法提取揮發(fā)油。

2.2 揮發(fā)性成分的測定條件

色譜條件色譜柱：DB-23（30 m×0.25 μm×0.25 mm）；載氣：氦氣（99.999%），柱流量：1.0 ml/min；柱前壓：53.6 kPa；柱初溫：50℃，程序升溫4℃/min至終溫230℃。

質(zhì)譜條件型號：QP2010；電離方式：標(biāo)準(zhǔn)EI電離；電離能：70eV；離子源溫度：200℃；接口溫度：250℃；汽化室溫度：250℃；掃描間隔：0.2 s/scan；倍增電壓：0.75 kV；掃描范圍m/z：30～500 amu。

3 結(jié)果

按照上述的分析條件，得到了編號為A1～A8的8種樣品的總離子流圖（見圖1），用島津儀器工作站的質(zhì)譜圖庫進(jìn)行檢索，設(shè)定相似度匹配的閾值為85%，對相似度匹配未能確定的重疊色譜峰利用HELP（直觀推導(dǎo)式演進(jìn)特征投影法）［3，4］方法進(jìn)行解析。表1 供試品編號及來源（略）

以藿香為例，圖1含其總離子流圖，用HELP法對整個二維數(shù)據(jù)進(jìn)行逐段解析可知，總離子圖中的許多色譜峰是重疊峰，甚至一些看似純的色譜峰也是混合組分的重疊峰，可見利用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法的必要性。下面以5 310～5 400（22.70～22.99 min）保留段的色譜峰為例具體介紹一下HELP的詳細(xì)解析過程。見圖2～3。

將解析得到的純色譜圖在NIST107版質(zhì)譜庫找出對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜，得到的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜和組分質(zhì)譜見圖5，最終確定這5個組分分別是7-亞甲基－2，4，4-三甲基－2-乙烯基－雙環(huán)［4.3.0］壬烷，(A，相似度為92.37%)；1α，4aα，8aα-7-甲基-4-甲烯基-1-異丙基-1，2，3，4，4a， 5，6，8a-八氫萘，(B，相似度為95.13%)；4(14)，11-桉葉二烯，(C，相似度為97.71%)；雅檻藍(lán)烯，(D，相似度為92.35%)；杜松烯，(E，相似度為94.85%)。按照上述過程，可逐步解析其他保留段的組分并進(jìn)行質(zhì)譜檢索。

常規(guī)的GC/MS檢測一般是用峰面積歸一化來定量，而且對重疊峰只能做近似處理，本研究中各組分的相對含量是利用分辨得到的各組分的純色譜曲線和質(zhì)譜，采用總體積積分法［6］作的定量分析。對8個植物揮發(fā)油樣品進(jìn)行了GC/MS定型鑒別后，選擇了A1～A8共同的鑒出組分，其名稱和相對含量見表2。表2 8種化濕藥的共有組分及其相對含量（略）

tr代表有該種物質(zhì)，但是含量很低，未能定量。 nd代表未能檢測到該物質(zhì)

4 討論

由表2可以看出，這8種化濕藥植物的共有揮發(fā)油組分包括脂肪族化合物、芳香族化合物、萜類衍生物等。萜類化合物是存在于植物界的一大類化合物，具有多種生物活性，并且是多種中藥的主要活性成分。8種藥材揮發(fā)油的共有組分中，含醇類化合物12個，醛類及酮類各1個，酚類3個，醚類4個，酯類7個，無氧單萜和倍半萜類化合物分別為10個和23個。

這8種化濕藥的揮發(fā)性成分中均含有桉葉油醇(Eucalyptol，含量0.01%～82.41%)和環(huán)氧石竹烯（Caryophyllene oxide，0.02%～5.5%），且前者為草果、佩蘭、草豆蔻揮發(fā)性物質(zhì)的主要成分，含量分別為36.12%，82.41%，27.92%。藿香獨(dú)有廣藿香醇(Patchouli alcohol)，脫氫醋酸(Dehydroacetic Acid）和α-布藜烯(alpha.-bulnesene)，相對含量分別為37.64%，20.55%，13.78%。厚樸獨(dú)有α-桉葉醇(alpha.-Eudesmol)和β-桉葉醇(beta.- Eudesmol)，相對含量分別為25.84%和34.25%。砂仁揮發(fā)性物質(zhì)中主要成分為樟腦(Camphor)，龍腦(Borneol)，乙酸龍腦酯(Bornyl acetate，)，檸檬烯(D-Limonene)［1］，實(shí)驗(yàn)測得砂仁中這幾種物質(zhì)的相對含量分別為21.16%，2.95%，56.47%，8.93%。

檢測到的藿香的主要活性成分有廣藿香醇(Patchouli alcohol，含量為37.64%)， α-愈創(chuàng)木烯(alpha.- Guaiene，含量為6.37%)，這與文獻(xiàn)［7］報(bào)道的一致；草豆蔻的主要活性成分有桉葉油醇(Eucalyptol，含量為27.97%)，這與文獻(xiàn)［8］報(bào)道的一致，但是另一主要成分對聚傘花烯(p-Cymene，含量為13.04%)，未見報(bào)道；厚樸的主要化學(xué)成分之一β-桉葉醇(beta.-Eudesmol，含量為34.25%)與文獻(xiàn)［9］報(bào)道的一致，但是另一主要成分α-桉葉醇(alpha.-Eudesmol，含量為25.84%)未見報(bào)道。

檢測到蒼術(shù)的主要成分為茅術(shù)醇（Hinesol）和苯乙烯基鄰二氮苯（4-Styrylpyridazine），含量分別為24.45%和23.79%，成分之一茅脘腹脹悶術(shù)醇與文獻(xiàn)［10］報(bào)道的湖北羅田和英山所產(chǎn)蒼術(shù)的主要揮發(fā)油成分一致，但后者未見報(bào)道。檢測到白豆蔻的主要揮發(fā)油成分除表中列出的香茅醇乙酸酯（Geranyl acetate，含量為5.37%）外，還有含量為9.75%的2-硝基，3，3，5，5-四甲基環(huán)己酮（2-nitro-3，3，5，5-tetramethylcyclohexanone）。

近些年來對各種單味中草藥的化學(xué)成分GC/MS研究較為常見，但大多數(shù)只是用儀器自帶的工作站根據(jù)質(zhì)譜定性，這種方法對于復(fù)雜的色譜峰通常得不到準(zhǔn)確的結(jié)果，對于噪聲較大的小峰也得不到準(zhǔn)確結(jié)果。利用GC/MS分析法結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分辨方法（如HELP）鑒定揮發(fā)油化學(xué)成分，比單獨(dú)使用GC/MS法結(jié)果更準(zhǔn)確、可靠。同時也為進(jìn)一步研究8味中藥的藥理藥效提供了化學(xué)成分的基礎(chǔ)。

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生物質(zhì)譜技術(shù)與方法范文第5篇

關(guān)鍵詞：電噴霧解吸質(zhì)譜；離子化

中圖分類號：Q63　文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A　文章編號：1006-431l(2012)02-0326-03

0　引言

從某種程度來講，質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展主要是基于離子源的發(fā)展和應(yīng)用。相當(dāng)長的一段時間內(nèi)由于電離技術(shù)的制約，質(zhì)譜方法只能對小分子的分子量進(jìn)行準(zhǔn)確、靈敏的測定。隨著電離技術(shù)的發(fā)展，尤其是ESI和MALDI的出現(xiàn)，大大提高了質(zhì)譜的測定范圍。特別是他們顯示在高極性、難揮發(fā)和熱不穩(wěn)定性生物大分子分析(如蛋白質(zhì)和核酸址：的巨大潛力，使質(zhì)譜技術(shù)真正走入了生命科學(xué)的研究領(lǐng)域。

目前。質(zhì)譜的主要發(fā)展方向是大氣壓質(zhì)譜(ambiem massspectrometry)，此質(zhì)譜離子化方法是將樣品離子化過程從真空狀態(tài)轉(zhuǎn)到大氣壓狀態(tài)下完成，包括，離子化、離子激活以及離子，分子反應(yīng)。這一發(fā)展避免了傳統(tǒng)的質(zhì)譜分析技術(shù)要求真空條件所導(dǎo)致的操作繁雜，樣品易發(fā)生污染、損失以及引入副反應(yīng)等缺點(diǎn)。因此，此技術(shù)將使質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用更加廣闊。

因此自2003年起，諸多新的質(zhì)譜技術(shù)、分析技術(shù)被開發(fā)出來，包括即時分析質(zhì)譜法(Direct Analysis in Real Time，DART)、電噴霧解吸法(Desorption EIectrospray Ionization，DESI)以及電噴霧輔助激光解吸法(Electrospray Assisted Laser Desorpfion Ionization，ELDI)等。這些解吸法都具備在大氣壓下直接分析的能力，可減少樣品前處理步驟，達(dá)到增加分析速度的且的。

電噴霧解吸電離是于2004年由Cooks研發(fā)出來的新的解吸技術(shù)，是一種在大氣壓條件下MS取樣分析的方法。電噴霧解吸離子化是電噴霧離子化(electrospray ionization，ESI)和解吸離子化(desorptlon／ionization，DI)兩大離子化技術(shù)的結(jié)合。因此。DESI既可以分析氣體、液體樣品，也可以分析固體樣品：既可以分析小分子化合物，也可以分析蛋白質(zhì)及其他生物樣品。

除此以外，DESI同傳統(tǒng)的解吸質(zhì)譜一樣，可對樣品進(jìn)行原位分析。但傳統(tǒng)的解吸質(zhì)譜(如，次級離子質(zhì)譜和基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜)分析生物樣品都需要在真空條件下進(jìn)行。只有大氣壓一基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜和AP-激光解吸附質(zhì)譜是例外，但這些方法不能夠進(jìn)行原位分析，樣品必須要根據(jù)離子源的位置固定，并且試驗(yàn)過程中不能觸動。而DESI能夠在自然環(huán)境下進(jìn)行原位分析，因而特別適于與TLC聯(lián)用。

并且，DESI可以直接、快速分析待測物，而不必經(jīng)過復(fù)雜的樣品預(yù)處理過程，即使是分析生物樣本(如，組織樣本)。而在真空狀態(tài)下，樣品預(yù)處理過程是必需的。目前，此離子化方式已用于多種化合物的痕量樣品分析，如，多肽，蛋白質(zhì)，核苷酸，內(nèi)源性物質(zhì)，藥物代謝物，硝基芳香族化合物等。

本文主要是針對電噴霧解吸電離的離子化機(jī)制，分析特點(diǎn)以及DESI在各個領(lǐng)域的應(yīng)用等方面進(jìn)行綜述。

1　DESI的工作原理

電噴霧解吸質(zhì)譜法與二次離子質(zhì)譜法(Secondary ion ma88spectrometry，SIMS)很類似，是利用電噴霧產(chǎn)生的帶電液滴及離子直接轟擊分析物的表面，吸附在表面的待測物受到帶電離子的撞擊以離子的形式從表面解吸出來，然后通過質(zhì)譜儀的常壓進(jìn)樣口進(jìn)入質(zhì)量分析器，所得到的質(zhì)譜圖與ESI極為相似，得到的是單電荷或多電荷的分子離子。

DESI離子化源雖然也利用EsI(Ehctrospray Ionization)。但是這里不是直接利用ESI自身產(chǎn)生的離子進(jìn)行質(zhì)譜分析，而是利用某些溶劑(如水和乙醇的混合溶液，有時還可加入酸性或堿性添加劑)形成的ESI射流對樣品進(jìn)行離子化。

DESI的詳細(xì)流程如下，首先于毛細(xì)管上施加一高電壓。使其產(chǎn)生電噴霧并形成氣相分子離子、離子簇(ionic cluster)、帶電液滴等。并提高輔助電噴霧的霧化氣體流速，在大氣壓力下藉由高速的氣體加速電噴霧產(chǎn)生的液滴或離子對分析物表面轟擊。使分析物解吸附游離出來。噴射物對分析表面的離子解吸附基于靜電力和氣體壓力。解吸附的氣相離子通過一個柔韌的金屬或絕緣體材料的質(zhì)譜儀常壓離子轉(zhuǎn)移通道傳送到遠(yuǎn)端的質(zhì)譜分析儀。圖1即為DESI離子化示意圖。

目前，電噴霧解吸法的解吸機(jī)制仍在推測階段，并未有確切的研究結(jié)果可以證實(shí)。以下是由Cooks R.G.提出四種可能的解吸機(jī)制：

1.1化學(xué)濺射機(jī)制(Chemical spattering)由電噴霧產(chǎn)生的氣相離子由高速氣體帶動下撞擊待分析物表面，氣相離子將電子、質(zhì)子或是其他離子轉(zhuǎn)移至待分析物表面，使得待分析物表面分子帶電荷。

DESI是在大氣壓力下操作，使得氣相離子受到空氣阻力而使其動能降低，因此并不能同ESI一樣，僅通過一次碰撞就可以將分析物由表面轟擊出來。而是，在表面積累電荷，當(dāng)累積到足夠的動能，或是當(dāng)其電荷密度累積到有足夠的電荷排斥力時，才能撞擊使樣品的分子離子由分析物表面解吸出來。

這種解吸過程類似化學(xué)離子化，易于發(fā)生在分析物分子量較小的情況下。

1.2氣相離子化機(jī)制(Gas phase ionization)具有揮發(fā)性的分析物從表面揮發(fā)至空氣中形成氣相分子，再與空氣中由電噴霧產(chǎn)生的氣相離子發(fā)生質(zhì)子，電子轉(zhuǎn)移或是離子，分子反應(yīng)而使分子物形成帶電荷離子。

此解吸機(jī)制易于發(fā)生在具揮發(fā)性的有機(jī)小分子上。

1.3液滴攜帶機(jī)制(Droplet pick-up)電噴霧產(chǎn)生的帶電液滴轟擊分析物表面，使分析物表面物質(zhì)溶于帶電液滴之中。液滴因帶電液滴的持續(xù)高速撞擊，產(chǎn)生大量含分析物的帶電小液滴。此后，帶電小液滴從表面解吸形成氣相分子離子的過程，與ESI解吸機(jī)制的電荷殘留模型(Charge Residue model)及場解吸模型(Fidddesorption model)相似。

此解吸機(jī)制適用于帶電多電荷的生物大分子。

1.4沖擊模型(Shookwave modal)沖擊模型的提出是為了解釋離子簇碰撞理論(massive cluster impact，MCI)而提出的，以解釋大分子化合物形成多電荷離子的現(xiàn)象。此離子億效應(yīng)不可能是由于核或電子碰撞產(chǎn)生，沖擊模型認(rèn)為是由于壓縮波碰撞產(chǎn)生的。離子簇與樣品表面碰撞后迅速崩解產(chǎn)生的壓縮波，其碰撞速度超過聲速，使大分子化合物形成多電荷離子。

沖擊模型使用于蛋白質(zhì)，多肽類等大分子化合物多電荷離子的

產(chǎn)生。

目前，雖然解吸機(jī)制仍沒有定論，但是大量實(shí)驗(yàn)表明，化學(xué)濺射機(jī)制和液滴攜帶機(jī)制可能是DESI離子化解吸機(jī)制的主導(dǎo)。由于實(shí)驗(yàn)中所檢測到的離子速度均小于聲速，因此沖擊波模型還沒有被證明。

2　DES J儀器最新進(jìn)展

2.1 DESI-IMS聯(lián)用技術(shù)離子遷移譜(ion-mobilityspectrometry，IMS)是一種氣相環(huán)境下電泳技術(shù)，它是根據(jù)分析物分子質(zhì)量、電荷和碰撞截面(即大小和形狀)來分離和辨別分析物。

目前將IMS技術(shù)與ESI和MALDI等離子化技術(shù)偶聯(lián)，并與MS技術(shù)聯(lián)用，已經(jīng)在蛋白質(zhì)和多肽分析研究方面取得相當(dāng)大成功，成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究最強(qiáng)有力工具。

利用IMS技術(shù)對異構(gòu)體多肽混合物的氣相構(gòu)象研究結(jié)果表明，IMS具有分辨結(jié)構(gòu)上僅存在微小差別的異構(gòu)體的能力，這是質(zhì)譜技術(shù)所不具備的。因此，ESI-IMS聯(lián)用技術(shù)在大分子結(jié)構(gòu)及構(gòu)象分析方面顯示非常突出的優(yōu)勢。

翻譯后修飾(如磷酸化、糖基化等)是蛋白質(zhì)調(diào)控其活性和功能的重要方式，也是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要內(nèi)容，因此分離篩選翻譯后修飾的多肽和蛋白質(zhì)具有重要意義。Ruotolo等利用IMS-MS技術(shù)實(shí)現(xiàn)了磷酸化多肽快速高通量分離篩選分析。

與ESI相比，DESI是在大氣壓下操作的，離子源相對簡單，都使得DESI更易與離子遷移譜相匹配。CooksR.G.將DESI與IMS-TOF偶聯(lián)，對細(xì)胞色素C和胞壁質(zhì)酶蛋白進(jìn)行檢測，所得到的質(zhì)譜圖，DESI與ESI結(jié)果非常相似，并且，從某種程度上講，DESI離子化過程更溫和，更易于得到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確信息?？梢?，將DESI與IMS偶聯(lián)具有更大的優(yōu)勢。

DESI-IMS聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展使得IMS既可以用于小分子分析，還能分析高分子量的生物大分子，再加上IMS本身靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，它必將會成為在生物領(lǐng)域有潛力的分析方法。

2.2聲波噴霧解吸離子化(Desorption sonic spray ionization,DeSSI)聲波噴霧解吸離子化(Desorpfion sonic spray ionization，DeSSI)是由DESI衍生出來新的離子化方式，是DESl與聲波噴霧離子化(sonic spray ionization，SSI)兩種離子化方式的結(jié)合。DeSSI設(shè)備更加簡單，是更軟的離子化技術(shù)。

與DESI不同之處僅在于，DeSSI利用聲波進(jìn)行噴霧。DeSSI的這個改進(jìn)，使其與DESI相比具有兩大優(yōu)點(diǎn)：①DESI是利用溶劑進(jìn)行噴霧，因此要在噴霧毛細(xì)管上施加高電壓(一般為4KV)，DeSSI不必施加高電壓，這而使其與大氣壓環(huán)境能夠更好的匹配。②DESI是利用溶劑進(jìn)行噴霧，噴霧溶劑所產(chǎn)生離子簇必將形成背景噪音。干擾樣品的測定。因此，與DESI相比，DeSSI使所得到的質(zhì)譜圖會更加清晰。這些特點(diǎn)都使得DeSSI對于分析小分子量化合物或雜質(zhì)有很大的優(yōu)勢。

超聲波具有很高穿透性，采用超聲波噴霧的DeSSI，能夠更好的測定樣品深層物質(zhì)，確保分析樣品的一致性。尤其對于組織在體分析定量分析非常有利。而且采用超聲波噴霧所得到的離子信號也更持久，更有利于檢測。

2.3 DESI-imaging影像質(zhì)譜法(Imaging mass spectrometry)有較長的歷史，但在分子領(lǐng)域，尤其是生物分子領(lǐng)域來講，影像學(xué)還屬于新生學(xué)科，有著廣闊的發(fā)展前景。

基于MALDI和SIMS的影像質(zhì)譜法已經(jīng)成為分析生物組織的組織學(xué)切片的有利手段。盡管如此，這些技術(shù)存在缺陷：離子化技術(shù)要求高真空條件下，并且樣品前處理過程中進(jìn)行的物理，化學(xué)處理都有嚴(yán)格的限制。

DESI的特點(diǎn)，使其具有影像質(zhì)譜法的潛力，可用于樣品表面各組分的分布分析(目前其物理分辨率已可達(dá)50p,m量級)。Cooks R.G.已采用DESI對在體或離體組織切片直接分析，以確定組織中分析物的分布。Demian等在負(fù)離子模式的質(zhì)譜測定過程中。由去質(zhì)子化的脂質(zhì)分子的豐富的二維空間分布，可以得到大鼠大腦組織中冠狀縫切面上的脂質(zhì)的分布。后面的分布情況還顯示了大鼠大腦不同的解剖特征。

DESI影像技術(shù)是MALDI影像技術(shù)的重要補(bǔ)充：MALDI適用于分析蛋白質(zhì)和多肽，而DESI更適合于類脂。但是DESI-imaging的分辨率較低，尤其是分析細(xì)胞內(nèi)的化合物。為了提高分辨率常采用以下方法：采用nano-Spray，以得到50μtm或更小的樣品斑：減小噴霧毛細(xì)管內(nèi)徑，由50μm縮小至10μm；增大質(zhì)譜儀常壓進(jìn)樣口的尺寸，以集中反射液滴，離子，以提高信號強(qiáng)度。

2.4微型化DESI另一個重要的發(fā)展方向就是微型DESI的研制工作。如何設(shè)計(jì)出更小的DESI裝置而并保持其性能不明顯降低，是微型DESI研究領(lǐng)域的主要目標(biāo)。

由于DESI的整個操作過程是在大氣壓力下進(jìn)行的，無需真空系統(tǒng)，儀器裝置結(jié)構(gòu)簡單，因此它易于微型化。微型化一直是DESI技術(shù)發(fā)展的一個主要方面。微型DESI所具有的易攜帶、體積小、能耗低等優(yōu)點(diǎn)使之特別適合現(xiàn)場分析(如，機(jī)場安檢以及刑事偵察等)。質(zhì)譜儀的微小化、商品化，可使用戶自己對于環(huán)境、健康狀況進(jìn)行檢測，為其進(jìn)入“私人質(zhì)譜儀”時代奠定基礎(chǔ)。

3　展望

幾年來，DESI技術(shù)的理論和檢測技術(shù)都已經(jīng)有了很大的發(fā)展，在各個領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越廣泛，并開始向性能的改進(jìn)及小型化方向發(fā)展。

雖然，DESI在某些領(lǐng)域的應(yīng)用已經(jīng)日趨成熟，但DESI儀器也存在一定的問題，如，對于組織分析，由于體內(nèi)環(huán)境干擾較大，DESI的分辨率較低，尤其是分析細(xì)胞內(nèi)的化合物，因此進(jìn)行定量分析比較困難。