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土壤微生物研究方向范文第1篇

關(guān)鍵詞： DNA提取 土壤 微生物多樣性

土壤是微生物生活的主要場所，蘊(yùn)含著豐富的微生物資源并表現(xiàn)出高度的多樣性，據(jù)估計每克土壤中含有4000-7000種近109個細(xì)菌細(xì)胞，含有幾千到上百萬種不同的基因組信息。長期以來，對土壤微生物的研究僅限于極少部分可培養(yǎng)的微生物，而這種可培養(yǎng)的微生物還不到自然界微生物總量的1%，實際上絕大多數(shù)環(huán)境微生物都是不可或很難被培養(yǎng)的，利用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法研究土壤微生物多樣性，具有很強(qiáng)的偏好性。隨著發(fā)展起來的宏基因組學(xué)利用分子生物學(xué)的研究方法繞過培養(yǎng)方法來研究微生物多樣性及功能這一局限，為土壤微生物研究開辟了新的道路[1]。而宏基因組學(xué)技術(shù)在研究土壤微生物方面的關(guān)鍵第一步是提取DNA。

提取高濃度、大片段、多樣性程度高、具有代表性的土壤微生物總DNA對土壤微生物多樣性研究至關(guān)重要。然而，土壤是一個非常復(fù)雜的異質(zhì)體系，其中含有的腐植酸及腐植酸類似物、酚類化合物、重金屬離子等，在DNA提取過程中如不能有效去除，將直接影響后續(xù)的PCR擴(kuò)增、核酸雜交、內(nèi)切酶消化等分子操作[2]。土壤微生物DNA的提取純化是一個耗時、繁瑣的過程，許多學(xué)者一直在探索更加快速、高效、低成本的土壤DNA提取方法。下面就近年來已發(fā)表的國內(nèi)外DNA提取相關(guān)方面的文獻(xiàn)，對DNA提取作了些論述。

一、土壤DNA

土壤中的DNA主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，核內(nèi)DNA占整個細(xì)胞DNA量的90%以上，核外DNA主要有線粒體DNA和質(zhì)粒DNA，因此，土壤DNA提取主要獲得的是核內(nèi)DNA[3]。

二、影響土壤DNA提取的主要因素

影響土壤DNA提取的因素主要有以下幾點：1）DNA與土壤環(huán)境基質(zhì)的相互作用。DNA與粘土礦物、高含量有機(jī)質(zhì)等之間的吸附會降低DNA提取產(chǎn)量。2）DNA共提取物。土壤中含有的腐植酸及腐植酸類似物、酚類化合物、重金屬離子等對土壤DNA提取存在影響，限制性內(nèi)切酶活性在共提取的腐植酸濃度為0.8-51.71μg/mL時就受到抑制，且Taq聚合酶對腐植酸具有高抑制敏感性[4]。3）DNA的降解、損失或損傷。土壤樣品保存方法不當(dāng)，會導(dǎo)致微生物細(xì)胞降解或DNA降解，如土壤樣品儲存在4℃下3周，高分子量DNA顯著減少[5]；還有DNA提取過程越繁瑣或步驟越多，DNA損失就越多，DNA提取過程中的剪切力也會對DNA分子會造成損傷。4）細(xì)胞不完全裂解。

三、土壤DNA提取方法

土壤樣品的DNA提取，通常包括細(xì)胞裂解、細(xì)胞碎片的去除和核酸的沉淀與純化三個步驟。根據(jù)微生物細(xì)胞是否需要從他們的環(huán)境基質(zhì)中分離出來，可將DNA提取方法分為直接法和間接法，直接法耗時短且具有更好的DNA恢復(fù)率，可以獲得更好體現(xiàn)樣品微生物多樣性的代表性DNA，從而直接法得到更為普遍的應(yīng)用[6]。

已經(jīng)出現(xiàn)了很多被接納并廣泛使用的土壤DNA提取方法，可以說這些方法被當(dāng)作了標(biāo)準(zhǔn)。其中，Zhou 等[7]于1996年提出了一種多元組成土壤DNA恢復(fù)方法，該研究為應(yīng)對某一具體的土樣提供了指導(dǎo)便于選擇適當(dāng)?shù)腄NA提取和純化方法。有人在此基礎(chǔ)上，改進(jìn)了方案，來提取幾種性質(zhì)不同的土壤樣品DNA，并得到了較好的結(jié)果[8]。而有些土壤樣品來自于極端環(huán)境或由于本身特性，提取出滿足用于分子分析的DNA比較困難。這時結(jié)合使用不同的細(xì)胞裂解方法就顯得特別重要（常見的細(xì)胞裂解方法見表1）。例如引進(jìn)土壤預(yù)洗滌程序用于提取一般有機(jī)質(zhì)（腐植酸）和金屬離子含量比較高的森林土樣DNA，DNA提取產(chǎn)量和質(zhì)量可以得到改善[9]。風(fēng)沙土壤本身微生物數(shù)量較低，需要采取特殊的土壤處理方法，以獲得足夠產(chǎn)量的DNA，張穎等人也報道了一種風(fēng)沙土壤微生物總DNA提取方法，獲得的DNA可直接用于PCR分析[10]。還有，一些極端環(huán)境如火山土壤樣品DNA提取面臨著粘土和其他礦物含量高的難題，Ruth M.Henneberger等[11]嘗試了各種提取方法，最終成功地提取到了效果較好的DNA，這都證明了結(jié)合使用不同提取處理的重要性。

DNA提取技術(shù)除了在土壤樣品上的應(yīng)用外，還有很多其他的環(huán)境樣品如沉積物、堆肥、植物組織、動物標(biāo)本、消化物或糞便、骨骼牙齒、化石冰與凍土、碳酸鹽巖石、唾液等。另一方面，DNA提取技術(shù)的不斷發(fā)展與成熟也促進(jìn)了市場上出現(xiàn)了許多各種各樣的商業(yè)化DNA提取試劑盒。S.M. Dineen等[12]比較了6種商業(yè)DNA提取試劑盒用于三種土樣細(xì)菌孢子的DNA提取，結(jié)果表明FastDNA？SPIN kit提取DNA產(chǎn)率最高，而E.Z.N.A.？Soil DNA和PowerSoil？DNA Isolation kits在去除壤土提取物中PCR抑制物方面表現(xiàn)出最高的效率。

以上所訴的大多屬于直接法，直接法雖然產(chǎn)量高，但是純度一般較低，有時需要進(jìn)一步的純化，獲得的DN段也較?。幌鄬Χ?，間接法雖然需要另外的特殊處理材料和足夠的土壤數(shù)量，耗時長，但獲得的DNA純度高、長片段多，且含有更少的真核基因序列，在進(jìn)行深入的微生物群落測序和克隆構(gòu)建福斯質(zhì)粒文庫方面，間接法是一個有用的方法[13]。

四、土壤DNA提取方法對土壤微生物多樣性分析的偏差影響

已報道的從土壤中提取DNA的方法有很多種，但大多數(shù)只適用于有限的土壤類型，這些核酸提取方法也會有復(fù)雜的低效性，不可避免地會引進(jìn)各自的偏差[14]。Jan Dirk van Elsas等[15]比較分析了四種提取方法獲得的DNA多樣性，發(fā)現(xiàn)方法對表觀豐度和群落結(jié)構(gòu)有明顯的影響，其中，通過兩種方法獲取土壤DNA得到了一種迄今未描述的放線菌組。為了改善宏基因組方法，研究DNA提取偏差以及提供一些工具便于評價不同組的豐度，Tom O.Delmont等[16]人也設(shè)計并開展了實驗，他們的工作強(qiáng)調(diào)了提取的DNA庫與目前無法獲取的完整土壤宏基因組之間的不同。

目前，絕大多數(shù)土壤微生物基因組總DNA提取時采用的是一次裂解，而一次裂解并不能得到較為完全的土壤宏基因組，因此一般基于提取的DNA分析獲得的土壤微生物多樣性可稱為表觀土壤微生物多樣性。為了盡量獲取完整的土壤樣品DNA，Larry M.Feinstein等[17]在評估了一個常用土壤DNA提取試劑盒時，改變了細(xì)胞裂解方案，對粘土、砂土和有機(jī)質(zhì)土壤子樣品進(jìn)行多次連續(xù)DNA提取，得出大部分DNA能夠通過前幾次提取獲得，并且通過集中三次連續(xù)提取，DNA提取的偏差可以得到很大程度降低。同樣，郭等的實驗結(jié)果也證實了這點，土壤DNA的3次連續(xù)提取最低回收率占5次連續(xù)提取的76%以上，而且與新鮮土壤相比，風(fēng)干過程顯著降低了土壤微生物豐度，但利用風(fēng)干土壤中微生物豐度的變化趨勢反映新鮮土壤中微生物數(shù)量變化規(guī)律具有一定的可行性，這也為使用風(fēng)干土壤進(jìn)行土壤微生物多樣性研究提供了一定的依據(jù)[18]。

五、討論與展望

對于同一份土壤樣品，不同的DNA提取方法獲得的DNA往往具有差異而表現(xiàn)出方法特異性。DNA提取也會有復(fù)雜的低效性，土壤宏基因組DNA的不完全提取，土壤中的腐植酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)對PCR的抑制，這些都會對土壤微生物多樣性造成偏低的評估，提取的土壤DNA質(zhì)量將直接影響到后續(xù)的分子生物學(xué)分析的真實性。目前，沒有一種DNA提取方法適用于所有類型的土壤樣品，在面對一些棘手的土壤樣品DNA提取時，可采取一些不同的提取方法。

土壤DNA提取是進(jìn)行土壤分子生物學(xué)分析的關(guān)鍵步驟，也是一個限制步驟。隨著PCR芯片和高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng)用，對大批量土壤樣品DNA的快速獲取也變得迫切需求。雖然市場上出現(xiàn)的商業(yè)DNA提取試劑盒已為土壤DNA的獲取提供了不少方便，但在應(yīng)對較多的土壤樣品量，還是需要消耗較多時間來手工操作，缺乏自動高效性。 因此，必須尋求更加高效的DNA提取方法?！?/p>

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土壤微生物研究方向范文第2篇

關(guān)鍵詞：綠肥；玉米；產(chǎn)量

中圖分類號：S572 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1674-0432（2011）-03-0085-2

1 材料與方法

1.1 供試材料及方法

試驗安排在桐梓縣官倉鎮(zhèn)紅旗村響水組宋澤貴責(zé)任地進(jìn)行，當(dāng)?shù)睾０?00m，地勢平坦，交通方便。供試土壤為黃沙泥土，土壤肥沃，土層深厚，質(zhì)地疏松，其土壤理化性質(zhì)為：有機(jī)質(zhì)21.5g/kg，全氮1.37g/kg，有效磷23.5mg/kg，速效鉀253mg/kg，緩效鉀515mg/kg，PH值6.7。參試綠肥品種為箭舌豌豆，玉米品種益玉六號，種子由桐梓縣農(nóng)牧局提供。

試驗于2009年10月下旬進(jìn)行，選擇地勢平坦，土壤肥力均勻，交通方便的田塊，將該田塊劃分為面積一樣的兩個小區(qū)（即兩個處理），其小區(qū)面積為100m2（長10m×寬10m），即處理1：凈作箭舌豌豆；處理2：閑置區(qū)(不種植任何作物)。箭舌豌豆于2009年10月下旬播種，期間田間進(jìn)行常規(guī)管理，來年3月下旬全部翻壓還田。待箭舌豌豆全部腐爛后作梗分隔，將兩個小區(qū)分隔。于4月下旬兩小區(qū)（處理）分別采用單株定向移栽玉米，玉米移栽規(guī)格：行窩距50cm×24cm。田間管理同于常規(guī)。試驗在箭舌豌豆種植前、箭舌豌豆翻壓腐熟后、閑置小區(qū)內(nèi)分別取樣測定。

土壤取樣方法：隨機(jī)掘取20×20見方的整段土體，取樣刀剝?nèi)ネ鈱油寥溃缓髮⑼寥阑旌暇鶆颍脺缇Ｆぜ垖⑼翈Щ貙嶒炇曳治觥?/p>

1.2 測定指標(biāo)及方法

土壤有機(jī)質(zhì)含量的測定采用重鉻酸鉀氧化法（外加熱法）；土壤速效磷含量測定采用分光光度計鉬酸銨比色法；土壤速效鉀含量測定采用火焰光度法。其具體方法參考《土壤農(nóng)化分析》（鮑士旦主編，中國農(nóng)業(yè)出版社）。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠肥翻壓腐熟后對玉米農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量差異分析

表1 綠肥翻壓后對玉米農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量差異分析

綠肥翻壓腐熟后對玉米農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量試驗結(jié)果見表1，可見：從產(chǎn)量方面來看，綠肥翻壓腐熟后種植的玉米產(chǎn)量達(dá)6637.5kg/hm2，較閑置區(qū)種植的玉米增產(chǎn)589.5kg/hm2，增產(chǎn)率9.7%。從玉米農(nóng)藝性狀方面來看，綠肥翻壓后種植的玉米，其穗長、穗粗、穗行數(shù)、行粒數(shù)、裸穗鮮重等農(nóng)藝性狀均較閑置區(qū)種植的玉米表現(xiàn)要好，其穗長、穗粗、穗行數(shù)、行粒數(shù)、裸穗鮮重分別較閑置區(qū)玉米增加了2.8cm，0.3cm，2.4cm，3cm，60g，而禿頂長綠肥翻壓區(qū)玉米較閑置區(qū)玉米降低了0.4cm。說明種植綠肥且讓綠肥還田既能培肥地力、保護(hù)生態(tài)環(huán)境，又能滿足下季作物對時間和空間的需求，滿足下季作物對養(yǎng)分的需要，為下季作物獲得高產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，從而使下季作物玉米植株粗壯，果實飽滿，獲得豐產(chǎn)。

2.2 綠肥翻壓腐熟后對土壤養(yǎng)分含量變化差異分析

綠肥翻壓腐熟后對土壤養(yǎng)分含量影響見表2，綠肥翻壓區(qū)土壤養(yǎng)分含量均得到提高，綠肥翻壓區(qū)土壤有機(jī)質(zhì)含量、有效磷含量、速效鉀含量、全氮含量分別較閑置區(qū)土壤有機(jī)質(zhì)含量、有效磷含量、速效鉀含量、全氮含量提高了0.63g/kg，2.5mg/kg，9mg/kg，0.07g/kg。原因可能是種植綠肥使土壤中微生物數(shù)量大幅度增加，土壤微生物能將土壤中不易被植物吸收利用的有機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可給態(tài)的無機(jī)物質(zhì)，加速土壤中氮磷元素分解，增加土壤有機(jī)質(zhì)含量，提高土壤養(yǎng)分有效性。而土壤緩效鉀含量綠肥翻壓區(qū)較閑置區(qū)土壤緩效鉀含量降低了10.2mg/kg。說明箭舌豌豆這種綠肥對土壤緩效鉀含量影響不明顯。

表2 綠肥翻壓后對土壤養(yǎng)分含量變化差異分析

3 結(jié)論

通過大田試驗，研究了綠肥翻壓腐熟后種植玉米的產(chǎn)量、農(nóng)藝性狀以及土壤養(yǎng)分含量獲得如下結(jié)論：

3.1 綠肥翻壓后種植的玉米其農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量都較閑置區(qū)種植的水稻要好

綠肥翻壓后種植的玉米產(chǎn)量達(dá)6637.5kg/hm2，較閑置區(qū)種植的玉米增產(chǎn)589.5kg/hm2，增產(chǎn)率9.7%。綠肥翻壓后種植的玉米，其穗長、穗粗、穗行數(shù)、行粒數(shù)、裸穗鮮重等農(nóng)藝性狀均較閑置區(qū)種植的玉米表現(xiàn)要好。

3.2 綠肥翻壓后土壤養(yǎng)分含量均較閑置區(qū)土壤養(yǎng)分含量要高

原因可能是種植綠肥使土壤中微生物數(shù)量大幅度增加，土壤微生物能將土壤中不易被植物吸收利用的有機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可給態(tài)的無機(jī)物質(zhì)，加速土壤中氮、磷元素分解，增加土壤有機(jī)質(zhì)含量，提高土壤養(yǎng)分有效性，從而使土壤中養(yǎng)分資源得到高效利用，并為下季作物對養(yǎng)分需求奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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土壤微生物研究方向范文第3篇

[關(guān)鍵詞] 杭白芍；根際；變性凝膠梯度電泳；微生物多樣性；高效液相色譜；芍藥苷

[收稿日期] 2013-12-13

[基金項目] 中國博士后科學(xué)基金項目（2013M531484）；浙江省博士后科研項目（BSH1301033）；浙江省高校中青年學(xué)科帶頭人學(xué)術(shù)攀登項目（pd2013215）

[通信作者] 袁小鳳，博士，副教授，主要研究方向為藥用植物學(xué)，Tel：（0571）86633051，E-mail：

白芍為毛茛科芍藥屬植物芍藥Paeonia lactiflora的干燥根，在中國有悠久的栽培歷史，馳名中外，其根并入藥，能養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，斂陰止汗，柔肝止痛，平抑肝陽。臨床用于血虛萎黃，月經(jīng)不調(diào)，自汗，盜汗，肋痛，腹痛，四肢攣痛，頭痛眩暈。主產(chǎn)浙江、安徽、四川等地。此外，山東、貴州、湖南、湖北、甘肅、陜西、河南、云南等地亦產(chǎn)。浙江產(chǎn)杭白芍的品質(zhì)最佳，居全國芍藥之首，是著名的道地藥材“浙八味”之一。杭白芍為多年生草本，其生長周期4～6年，生產(chǎn)實踐中以4年收獲白芍根最為常見，藥典規(guī)定白芍飲片含芍藥苷（C23H28011）不得少于1.2%[1]。目前，在我國耕地面積降低以及后備耕地資源不足的情況下，為提高耕地利用率，有必要研究1～4年的杭白芍其藥效成分的累積動態(tài)及中藥品質(zhì)，了解生長年限對杭白芍品質(zhì)的影響，探索采收種植4年杭白芍的合理性。

研究表明，道地藥材是一個與生態(tài)環(huán)境、遺傳密切相關(guān)的開放的復(fù)雜系統(tǒng)[2]。道地藥材的道地性與產(chǎn)地的氣候、土壤理化條件等環(huán)境生態(tài)方面關(guān)系密切[3]。其中，土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的核心，它們直接或間接參與了土壤中幾乎所有的物理、化學(xué)和生物學(xué)反應(yīng)，對土壤肥力及植物生長代謝非常重要，對道地藥材內(nèi)在成分的質(zhì)量影響最大[4]。目前有關(guān)杭白芍的研究主要集中在藥效、栽培和加工等方面，對于白芍的土壤微生物等關(guān)注不多，而了解其微生態(tài)環(huán)境對杭白芍生長的作用，以及杭白芍的生長年限反過來對微生態(tài)環(huán)境的影響，有助于闡明杭白芍道地性形成的微生態(tài)作用機(jī)制。因此，作者栽培并收集了1～4年杭白芍的根，同時收集其根際土壤，利用HPLC檢測根中芍藥苷含量，利用PCR-DGGE檢測土壤菌群多樣性，分析杭白芍根際土壤微生態(tài)與杭白芍品質(zhì)的關(guān)系，為探索中藥道地性與環(huán)境生態(tài)的相關(guān)性提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)計和樣品采集 野外栽培實驗設(shè)在規(guī)范栽培基地磐安，實驗分4組：2011年栽培的杭白芍（一年生）；2010年栽培的杭白芍（二年生）；2009年栽培的杭白芍（三年生）；2008年栽培的杭白芍（四年生）。實驗地設(shè)在同一塊地，土壤類型完全相同，每一組1 m×5 m，相鄰而種，整個實驗過程設(shè)專人管理。2011年的7月12日晴天下午14：00左右采樣，用五點取樣法分別采集一至四年生杭白芍根及其根際土壤[5]。采樣時，刨去表層土壤，將白芍整個植株挖出，輕輕抖掉根系上的大塊土壤，收集仍舊黏附于根部的土壤顆粒，每組大概隨機(jī)采集10株左右，所收集的土壤混勻，過20目篩，以去除動植物殘體和石塊，此為根際土。將混合的根際土裝入50 mL無菌離心管，每組3管，放入冰盒，速帶回實驗室，保存于-20 ℃冰箱中，用于菌群多樣性檢測。同時采集50 g左右的根際土裝入無菌袋中，這部分土樣將自然風(fēng)干，用于土壤理化性質(zhì)檢測。非根際土為對照土，是指與根際土相對應(yīng)的土壤，采自與植物杭白芍根際有一定距離的同一地塊中，采集后現(xiàn)場處理方法同根際土。此外，采挖芍藥根，除去根莖及須根，洗凈，刮去粗皮，入沸水中略煮，使芍根發(fā)軟，撈出曬干、切片、打粉后待用[1]。每個樣品3個重復(fù)。

1.2 土壤pH、有機(jī)質(zhì)及酶活的檢測 采用電極法[6]測土壤pH，低溫外熱重鉻酸鉀氧化-比色法[7]測土壤有機(jī)質(zhì)，苯酚-次氯酸鈉比色法[8]測土壤脲酶活性，磷酸苯二鈉比色法[8]測定土壤磷酸酶活性。

1.3 土壤總基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增 稱取1.0 g土壤樣品進(jìn)行總基因組DNA的提取，具體的提取步驟按照UltraCleanTM土壤DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行，提取完成后用1%的凝膠電泳進(jìn)行檢測，將獲得的DNA放置-20 ℃冰箱保存。將提取的土壤DNA作為模板，使用Eppendorf的PCR system 2700型基因擴(kuò)增儀，采用細(xì)菌通用引物對F357和R518（F357： 5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′；R518： 5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′），同時，在上游引物F357前加了GC夾CGCCCGCCGCCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCC[9]，以提高變性凝膠梯度電泳DGGE的分離效果。

PCR反應(yīng)體系50 μL包括20～50 ng的DNA模板，25 pmol引物，100 μmol?L-1 dNTPs，2.5 μL的二甲基亞砜（DMSO）以及5 U的Taq DNA聚合酶。采用Touchdown-PCR策略：94 ℃預(yù)變性4 min，前20個循環(huán)，94 ℃變性45 s，65 ℃退火75 s（每個循環(huán)下降0.5 ℃），72 ℃延伸1 min；后10個循環(huán)為94 ℃變性45 s，55 ℃退火75 s，72 ℃延伸1 min，最后再72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化（Axygen DNA分離純化試劑盒，美國），-20 ℃冰箱保存。

1.4 DGGE及測序 利用DGGE（BioRad，美國）分離PCR產(chǎn)物。制備變性梯度膠，使其變性梯度為30%～60%，電泳緩沖液為1×TAE。DGGE電泳條件為：電壓160 V，溫度60 ℃，時間6.5 h。電泳結(jié)束后，SYBR-green I染色30 min，將染色后的DGGE膠用凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc 2000（BioRad，美國）拍照保存，用于多樣性分析。DGGE電泳之后，選擇相對比較清晰的條帶進(jìn)行割膠回收，用F357/R518引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化PCR產(chǎn)物。分子克隆選用pMD18-T載體，宿主為Escherich coli DH 5α（Takara，日本）。將質(zhì)粒送檢測序（Invitrogen，上海），運(yùn)用Blastn程序?qū)⑺鶞y序列與GenBank進(jìn)行同源比對（http：//ncbi.nlm.nih.gov/blast），并在RDP Ⅱ數(shù)據(jù)庫中（http：//rdp.cme.msu.edu）對序列進(jìn)行種屬鑒定。

1.5 芍藥苷含量的檢測 根據(jù)《中國藥典》2010年版規(guī)定，利用高效液相色譜法檢測杭白芍根部芍藥苷的含量[1]。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86）為流動相；檢測波長230 nm。理論板數(shù)按芍藥苷峰計算應(yīng)不低于2 000。取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成60 mg?L-1芍藥苷溶液，即得對照品溶液。取本品中粉末0.l g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加稀乙醇，即為供試品溶液。將供試品利用HPLC進(jìn)行芍藥苷含量的檢測。

1.6 數(shù)據(jù)分析及處理 利用軟件Quantity One 4.4（Bio-Rad，美國）分析DGGE圖譜。根據(jù)DGGE膠條帶的位置和強(qiáng)度計算Shannon指數(shù)[10]。數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件作Pearson相關(guān)性分析和主成分分析。實驗數(shù)據(jù)用±s（STDEV）表示，方差分析認(rèn)為，P

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長年限土壤的部分理化性質(zhì)差異 檢測發(fā)現(xiàn)土壤呈酸性，非根際土pH達(dá)3.86，而種植杭白芍能顯著降低土壤酸度，并且隨著栽培年份的增加，pH逐漸上升，酸度逐漸下降，二年生和三年生的pH無顯著性差異。隨栽培年份增加，根際土壤的有機(jī)質(zhì)基本呈逐漸下降的趨勢，但不同組間無顯著性差異。脲酶和磷酸酶活性均呈現(xiàn)出先降后升高的趨勢，但只有磷酸酶活性呈現(xiàn)出組間的顯著性差異，見表1。總之，隨著杭白芍的生長，到第4年杭白芍收獲時，土壤pH、酶活均達(dá)到最高水平，而有機(jī)質(zhì)則為最低。此外，與非根際土相比，根際土壤的pH、有機(jī)質(zhì)含量以及酶活性差異非常明顯，體現(xiàn)了杭白芍的根際效應(yīng)。這些均說明杭白芍的生長會影響土壤的理化性質(zhì)，而這種影響必定與根泌物相關(guān)，從而使土壤性質(zhì)呈現(xiàn)一定的動態(tài)變化。

2.2 不同生長年限土壤細(xì)菌多樣性 對不同生長年限杭白芍根際和非根際土進(jìn)行細(xì)菌多樣性分析，見圖1。從DGGE圖譜可看出，一至四年生的杭白芍根際土中有不少為共有條帶。與非根際土相比，根際土的DGGE條帶顯示出明顯的差異，表明杭白芍的根能吸引一些細(xì)菌的生長和聚集，即杭白芍在土壤菌群的組成上可能起主要的決定作用。比較不同年限的根際土發(fā)現(xiàn)，一至四年生的杭白芍根際大部分都是共有條帶，其差異主要體現(xiàn)在條帶的亮度，進(jìn)行重復(fù)實驗，其結(jié)果相同，這表明栽培年限對杭白芍根部的細(xì)菌群落影響不大，進(jìn)一步證明其土壤根際菌群的組成主要受到杭白芍物種的影響。

衡量物種多樣性的方法有許多，本文采用Shannon-Weiner指數(shù)[10-11]。結(jié)果表明，不同生長年限的杭白芍根際土之間的Shannon指數(shù)有差異，排序為三年生（3.61）>四年生（3.59）>二年生（3.39）>一年生（3.38），可以看出，隨著杭白芍生長年限的延長，根際土壤的細(xì)菌多樣性整體呈上升趨勢。此外，與非根際土相比，杭白芍根際土的多樣性指數(shù)顯著高于非根際土，說明杭白芍的生長促使在細(xì)菌在根部富集，體現(xiàn)出明顯的根際效應(yīng)。

為進(jìn)一步了解杭白芍土壤菌群結(jié)構(gòu)，將DGGE圖譜中比較清晰的條帶進(jìn)行割膠回收（圖1），共回收了21條帶，進(jìn)行分子克隆后測序，在NCBI和RDP數(shù)據(jù)庫中比對，結(jié)果見表2。測序結(jié)果表明，21個克隆全部為未培養(yǎng)菌，條帶長度在168～194 bp，主要隸屬于γ變形菌Gammaproteobacteria（5條帶，24%），α變形菌Alphaproteobacteria（3條帶，14%），放線菌Actinobacteria（4條帶，19%），酸桿菌Acidobacteria（2條帶，10%），厚壁菌門Firmicute（2條帶，10%）以及未知菌（5條帶，23%），說明杭白芍的根際土壤中的優(yōu)勢細(xì)菌為γ變形菌、α變形菌、放線菌、酸桿菌以及厚壁菌。從圖1可以看出，S6（uncultured Actinobacterium clone E1B-B3-114，放線菌），S8（uncultured Bacterium clone mus-c48，酸桿菌Gp1），S9（uncultured Bacterium clone 106.52，α變形菌），S10（uncultured Alphaproteobacterium clone 3OL8，α變形菌），S11（uncultured bacterium RNA B1001R002_G23，酸桿菌Gp1），S15（uncultured Bacterium RNA，未知菌）是根際土的特有條帶，說明杭白芍根際特有菌主要為α變形菌，酸桿菌Gp1和放線菌。S1，S2，S5，S7條帶在非根際土特有，而且非常亮，經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)除S2為未知菌外，其余均為γ變形菌，說明γ變形菌為非根際土中的優(yōu)勢菌群。

2.3 不同生長年限杭白芍的芍藥苷累積動態(tài) 按照藥典[1]規(guī)定，從實驗基地采回杭白芍根后，洗凈，除去頭尾和細(xì)根，置沸水中煮后除去外皮、生曬、切片、打粉后備用。從不同栽培年份的杭白芍的新鮮根可以非常明顯看到側(cè)根的生成以及次生生長。隨著杭白芍的生長，根系越來越發(fā)達(dá)，根的次生生長導(dǎo)致木質(zhì)化比例增加，周皮的顏色加深，主根越來越粗，而側(cè)根也越來越多。與一至三年生的杭白芍相比，四年生的根的生物量顯著增加，因此可以說，產(chǎn)量因素是選擇四年生杭白芍入藥的原因之一。將采來的樣本處理好后，利用高效液相色譜法對不同生長年限杭白芍的芍藥苷含量進(jìn)行了測定，見圖2。隨著生長年限的延長，芍藥苷的含量逐漸上升，其中一年生的含量最低，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.26%，四年生的芍藥苷含量最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)3.41%，但不同年份含量的統(tǒng)計性差異未達(dá)到顯著水平。由于一至四年生的杭白芍的芍藥苷含量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過國家標(biāo)準(zhǔn)，說明生長年限對芍藥苷的含量的影響不大，應(yīng)該不是選擇四年生杭白芍入藥的主要原因，之所以選擇四年生杭白芍入藥其主要因素應(yīng)該是產(chǎn)量而不是芍藥苷的含量。綜合外觀性狀質(zhì)量、產(chǎn)量以及指標(biāo)成分含量分析，栽培杭白芍以四年生最為適宜。

2.4 土壤性質(zhì)與芍藥苷含量的相關(guān)性分析 為了探索土壤對杭白芍生長的影響，對不同年限杭白芍根際土壤的pH、有機(jī)質(zhì)、酶活以及土壤細(xì)菌多樣性、芍藥苷含量的相關(guān)性進(jìn)行了分析（Spearman，1-tailed），結(jié)果見表3。pH與有機(jī)質(zhì)呈極顯著負(fù)相關(guān)，磷酸酶和脲酶活性呈顯著正相關(guān)，芍藥苷含量與土壤pH、細(xì)菌多樣性呈顯著正相關(guān)，與有機(jī)質(zhì)呈顯著負(fù)相關(guān)。以上關(guān)系表明，芍藥苷的累積與土壤pH、有機(jī)質(zhì)和細(xì)菌多樣性密切相關(guān)。

3 討論

pH對土壤微生物群落有著復(fù)雜的作用，它可以通過影響營養(yǎng)吸收及根外細(xì)胞酶的分泌，進(jìn)而影響土壤微生物的生長，一般來說，弱堿性適合細(xì)菌和放線菌的生長，酸性適合真菌的生長[12]。土壤pH與栽培方式和種植年限密切相關(guān)，劉建霞等分析種植年限與黃瓜溫室土壤理化性質(zhì)變化規(guī)律的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，土壤pH隨種植年限的延長顯著降低[13]。許多研究均發(fā)現(xiàn)在持續(xù)一定年限后，設(shè)施栽培普遍出現(xiàn)土壤酸化和鹽漬化等現(xiàn)象[14]，在一些不適合連作的作物中表現(xiàn)尤為明顯，與本研究結(jié)果正好相反。分析認(rèn)為，這可能跟作物是否適合連作有關(guān)。不適合連作的植物多為一年生草本，而杭白芍為多年生半灌木，需連續(xù)種植4～5年才采收，這種栽培模式不同于連作，杭白芍在生長過程中與土壤的互作可能與其他易產(chǎn)生連作障礙的作物不同，其根泌物的成分可能會導(dǎo)致pH上升而不是下降，當(dāng)然杭白芍根泌物的成分還有待下一步實驗證明。同時，隨著杭白芍的栽培年限延長，細(xì)菌多樣性也明顯上升，該結(jié)果與連作障礙的作物也不同[15-16]。事實上，不同作物連作對土壤微生物的影響特性是不同的[17]，而作物連作對土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物的這種不同影響，可能也是有的作物不能連作，而有的作物能夠連作的原因之一[18]。

酸桿菌廣泛存在于自然界，在許多生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，主要分為8個類群Gp1-8，大多為嗜酸菌，目前對它們的了解還很少[19]。其中，Gp1類群對土壤pH非常敏感，當(dāng)土壤pH6.5時在土壤中幾乎檢測不到[20]。研究發(fā)現(xiàn)，杭白芍的根際土壤pH均

在植物生長過程中，根系作為植物和土壤的接觸部分，在從土壤中吸收水分、養(yǎng)分的同時，通過根分泌的方式向根周圍釋放出各種化合物，產(chǎn)生根際效應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控或影響植株的生長發(fā)育[23]。土壤微生物在植物根際的定殖及分布也會受到根系生長發(fā)育、環(huán)境條件等因素的影響而表現(xiàn)出較為明顯的根際效應(yīng)，并且根際微生物在調(diào)節(jié)根際微生態(tài)系統(tǒng)的動態(tài)平衡、提高藥材對環(huán)境的適應(yīng)性等方面起著非常重要的生態(tài)效應(yīng)[24-25]。根系分泌物是植物根系與根際微生物相互作用的信息物質(zhì)和決定因素[26]，由于根根際效應(yīng)往往導(dǎo)致根際及根表面的微生物種群密度和種類要明顯高于非根際土[27-29]。杭白芍也不例外，其根際土壤pH、有機(jī)質(zhì)含量、酶活性以及細(xì)菌多樣性明顯高于非根際土，體現(xiàn)出典型的根際效應(yīng)，這與杭白芍根際向環(huán)境中釋放有機(jī)化合物有關(guān)。

HPLC檢測結(jié)果表明，一年生的杭白芍其芍藥苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)已達(dá)3.26%，符合藥典規(guī)定，也就是說從藥效成分的含量方面來看，一年生的根就可入藥，但生產(chǎn)實踐中，一般要4年以后才采收，究其原因，可能主要跟產(chǎn)量和效益有關(guān)。杭白芍為多年生亞灌木，一年生的根部與4年的根相比，由于根的次生生長導(dǎo)致地下部粗厚的程度和產(chǎn)量大大增加。此外，相關(guān)性分析表明，芍藥苷的累積與土壤pH、有機(jī)質(zhì)和細(xì)菌多樣性關(guān)系密切，研究發(fā)現(xiàn)在道地產(chǎn)區(qū)磐安杭白芍的芍藥苷含量相當(dāng)高，初步證明杭白芍的道地性與磐安土壤微生態(tài)環(huán)境密切相關(guān)。在下一步的實驗中，將研究杭白芍的根分泌物的組成以及非道地產(chǎn)區(qū)與道地產(chǎn)區(qū)的杭白芍對比，進(jìn)一步探索杭白芍道地性形成的微生態(tài)作用機(jī)制。

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Effects of growth years of Paeonia lactiflora on bacterial community in

rhizosphere soil and paeoniflorin content

YUAN Xiao-feng， PENG San-mei， WANG Bo-lin， DING Zhi-shan

（College of Life Science， Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， China）

[Abstract] To explore the relationship between microecological environment and Paeonia lactiflora， the effects of growth years of P. lactiflora on rhizosphere bacterial communities were studied by PCR-DGGE and the paeoniflorin content determined by HPLC. Results showed that the soil pH increased with growing years of P. lactiflora. In the fourth year， soil pH and enzyme activity reached the highest level， while organic matter content was the lowest. The bacterial diversity had a positive correlation with growing years varied from 3.38 to 3.61. Sequencing results demonstrated that Gammaproteobacteria， Alphaproteobacteria， Actinobacteria， Acidobacteria and Firmicutes were predominant bacteria kinds in the soil of P. lactiflora. Gammaproteobacteria was only detected in the bulk soil， while Alphaproteobacteria， Acidobacteria_Gp1， Actinobacteria were only in the rhizosphere soil and the bacterial community among different growing years were similar except few species. HLPC results showed that paeoniflorin content was 3.26%， 3.30%， 3.36%， 3.41% separately from one to four-year-old P. lactiflora with an upward trend. The correlation analysis indicated that the paeoniflorin content had a positive correlation with soil pH and bacterial diversity， conversely， had a negative correlation with organic matter content. During the growth years the rhizosphere bacterial diversity increased without changes of predominant bacteria and the paeoniflorin content increased without significant differences while its production increased significantly， which was different from the plants showing replanting diseases. This is in line with the farming practice choosing 4-year-old P. lactiflora， but not the 1-3 year old one. In addition， the accumulation of paeoniflorin is closely related to soil pH， organic matter content and bacteria diversity， confirming that the geoherblism of P. lactiflora is closely related with microbial environment in the soil.

土壤微生物研究方向范文第4篇

關(guān)鍵詞：微生物學(xué)；實驗教學(xué)；改革

隨著現(xiàn)代生命科學(xué)的迅猛發(fā)展，對生物學(xué)專業(yè)學(xué)生的需求在日益增加。與之相適應(yīng)，許多高等院校都相繼設(shè)立了生物技術(shù)、生物工程、生物制藥等相關(guān)專業(yè)。微生物學(xué)是生命科學(xué)中各專業(yè)重要的專業(yè)基礎(chǔ)課。如何進(jìn)行微生物學(xué)實驗課教學(xué)改革，是廣大微生物學(xué)教育工作者面臨的新課題。

由于微生物學(xué)內(nèi)容豐富，涉及面廣，實踐性強(qiáng)，傳統(tǒng)的實驗課程教學(xué)體系已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足學(xué)生今后的發(fā)展。在微生物實驗教學(xué)中，我們發(fā)現(xiàn)雖然在詳細(xì)講解后進(jìn)行操作演示，但學(xué)生對標(biāo)準(zhǔn)的操作要領(lǐng)并不能很快掌握，以至于在實驗過程中還是犯同樣的習(xí)慣性錯誤。學(xué)生不能很好的掌握實驗過程中的具體和關(guān)鍵性的標(biāo)準(zhǔn)操作，不能很好的鍛煉學(xué)生的動手能力和創(chuàng)新能力的培養(yǎng)。因此，加大實驗教學(xué)力度，強(qiáng)化實踐教學(xué)環(huán)節(jié)等方面的改革勢在必行。實驗教學(xué)課件可以實現(xiàn)實驗過程中的一些細(xì)節(jié)表現(xiàn)。學(xué)生可以根據(jù)自己的情況有選擇的學(xué)習(xí)或?qū)﹄y點、重點反復(fù)的觀看和學(xué)習(xí)。課件操作方便，使用多媒體技術(shù)即可自動演示實驗過程，可以加強(qiáng)學(xué)生對實驗操作的認(rèn)識和思考，提高實驗教學(xué)的質(zhì)量。調(diào)整和增加新的實驗項目將一些獨立的知識點貫穿起來，既能增加學(xué)生的學(xué)習(xí)效率，又利于對大學(xué)生綜合素質(zhì)的培養(yǎng)與提高，激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。

一、擴(kuò)充和改進(jìn)微生物實驗項目，調(diào)整驗證性和綜合性實驗項目的比例

為了培養(yǎng)學(xué)生的綜合實驗?zāi)芰蛯W(xué)生的創(chuàng)新能力，體現(xiàn)微生物學(xué)實驗改革的科學(xué)性和實用性，經(jīng)過多年的摸索和實踐對已有實驗項目進(jìn)行了調(diào)整和改進(jìn)。新增加實驗項目2項：菌群生長動力學(xué)實驗和抗生素抗菌譜及抗生菌的抗藥性測定；調(diào)整實驗項目2個：① 實驗室環(huán)境和人體表面微生物的檢查。該部分是將“實驗室環(huán)境及人體表面微生物的檢查”這一實驗（6學(xué)時）進(jìn)行延伸。調(diào)整后的內(nèi)容是以該實驗為主線，在達(dá)到上述目的的基礎(chǔ)上，再加上細(xì)菌的劃線分離、純培養(yǎng)及菌種保藏等內(nèi)容，從而讓學(xué)生較系統(tǒng)的學(xué)習(xí)培養(yǎng)基制備、高壓滅菌、無菌操作技術(shù)，細(xì)菌培養(yǎng)、劃線分離、純培養(yǎng)技術(shù)、通過菌落特征對細(xì)菌進(jìn)行簡單分類以及菌種的保藏等知識和技能訓(xùn)練。另外，以該實驗為例子，給學(xué)生灌輸從環(huán)境中篩選菌種的方法步驟等。通過本部分的學(xué)習(xí)，學(xué)生能夠基本掌握微生物相關(guān)操作，建立無菌操作概念，了解菌種的篩選分離等基本知識，為以后的實驗準(zhǔn)備工作和研究型教學(xué)奠定基礎(chǔ)。② 將原來的“土壤微生物的分離和純化（8學(xué)時）”改為“土壤微生物的分離純化和鑒定（不限學(xué)時）”。調(diào)整后該部分內(nèi)容是讓學(xué)生以小組為單位對感興趣的課題進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研、實驗設(shè)計、實驗操作，篩選出自己感興趣的菌株并進(jìn)行鑒定（包括分離株的菌落特征、菌種的形態(tài)、大小、染色特性、生理生化特性等，再結(jié)合伯杰氏手冊進(jìn)行鑒定）和一定的應(yīng)用研究（如特殊降解性能），最后以科技論文的形式提交實驗報告，以及進(jìn)一步延伸作為自己的學(xué)士學(xué)位論文選題研究。在實驗過程中，開放實驗室，學(xué)生可以充分利用課余時間，根據(jù)需要安排時間。

針對微生物實驗在內(nèi)容上的調(diào)整，我們設(shè)計了新的實驗教學(xué)結(jié)構(gòu)層次。將實驗重組為基礎(chǔ)、專業(yè)、研究性三個教學(xué)層次，各層次均由指導(dǎo)、自主、綜合、設(shè)計等由易到難、循序漸進(jìn)、不同要求的實驗組成；以課程、課外，必做、選做，開放等多種形式開設(shè)；開放性實驗是在教師的指導(dǎo)下，學(xué)生獨立設(shè)計，獨立準(zhǔn)備和操作，從材料的準(zhǔn)備到實驗結(jié)束的全過程，都由學(xué)生獨立完成，完成較為完整和系統(tǒng)的實驗課題，使學(xué)生品嘗自己的研究成果。

二、標(biāo)準(zhǔn)化實驗操作光盤和實驗教學(xué)課件的制作

為滿足微生物學(xué)實驗課教學(xué)的需要，豐富教學(xué)手段，課程組組織以實驗操作經(jīng)驗豐富的教師為主，錄制了一套標(biāo)準(zhǔn)化實驗操作光盤，制作成教學(xué)課件（尤其是操作較為復(fù)雜，結(jié)果不易觀察的實驗，如：酵母菌的形態(tài)觀察、死活細(xì)胞的鑒別）。將實驗原理、實驗?zāi)康?、實驗器材、操作步驟、注意事項以及一些微生物形態(tài)與結(jié)構(gòu)以試聽形式展現(xiàn)給學(xué)生，這不僅增強(qiáng)了實驗操作演示的生動性，增加了教學(xué)的直觀性，而且還使學(xué)生能很快掌握操作要領(lǐng)，加強(qiáng)了記憶，從而提高了實驗教學(xué)水平。

三、改進(jìn)實驗教學(xué)的考核評價體系

傳統(tǒng)的實驗考核的方式主要以實驗報告為主，針對這樣的考核方式，學(xué)生常出現(xiàn)相互之間抄襲，作業(yè)敷衍的現(xiàn)象，既不能反映學(xué)生實驗的真實水平，考核指標(biāo)也比較單一。針對這些問題，結(jié)合實驗教學(xué)的改革實際，我們重新制訂了實踐教學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)。首先加大了實驗成績在該課程總成績的中比例，由原來的10%提高到20%；成績構(gòu)成包括理論水平、實際操作技能和實驗報告三部分，將開放性實驗設(shè)計方案納入評分范圍，實驗進(jìn)行過程中記錄平時成績，對實驗結(jié)果不做硬性要求，但可作為評分參考。

四、總結(jié)

實驗課大多為理論課的附屬課程，實驗成績往往作為理論課成績的參考或以很低的比例計入理論課成績，在一定程度上造成了學(xué)生輕視實驗學(xué)習(xí)和實驗?zāi)芰Φ呐囵B(yǎng)。微生物實驗課是生命科學(xué)所有本科專業(yè)的必修基礎(chǔ)課，每年有幾百名學(xué)生進(jìn)入實驗室學(xué)習(xí)，對實驗項目的的調(diào)整可使眾多學(xué)生受益。目前調(diào)整的實驗項目和教學(xué)課件已經(jīng)用于實驗教學(xué)，效果很好。與以前相比，學(xué)生能夠更好地掌握微生物最基本的操作技能，了解微生物學(xué)的基本知識，加深對微生物知識的理解；學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣、創(chuàng)造性、積極性都被充分挖掘、調(diào)動起來，能夠主動地去了解日常生活中的微生物與我們?nèi)祟惖年P(guān)系，并且養(yǎng)成了良好的學(xué)習(xí)習(xí)慣，為今后的學(xué)習(xí)打下了堅實的基礎(chǔ)；學(xué)生能夠與別人很好的協(xié)調(diào)與合作，培養(yǎng)了他們的團(tuán)隊精神?？傊?，通過項目調(diào)整提高了實驗教學(xué)質(zhì)量，培養(yǎng)了學(xué)生的綜合素質(zhì)。今后我們還將繼續(xù)進(jìn)行改進(jìn)，以期獲得最佳的教學(xué)模式，推動實驗教學(xué)的改革進(jìn)程，使實驗課教學(xué)真正能夠達(dá)到應(yīng)有的效果。

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土壤微生物研究方向范文第5篇

關(guān)鍵詞：土壤呼吸；碳、氮循環(huán)；陸地生態(tài)系統(tǒng)

中圖分類號：S 15文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：10095500（2013）06008707

在過去的一個世紀(jì)里，化石燃料的燃燒和人工施肥的增加使得陸地生態(tài)系統(tǒng)的氮素添加增加了3～5倍[1]，而且在全球的很多區(qū)域這種氮素添加還會增強(qiáng)。因氮素添加模型的研究結(jié)果表明本世紀(jì)末大氣氮沉降將會是現(xiàn)在的2.5倍。這種氮沉降對陸地生態(tài)系統(tǒng)有著不同的作用，例如低濃度的大氣氮沉降能夠刺激植物的生長和固碳能力[2-4]；高濃度的氮沉降會導(dǎo)致生物多樣性的降低，土壤酸化以及養(yǎng)分的流失[5，6]。

碳、氮循環(huán)作為生物地球化學(xué)循環(huán)和能量流動的重要基礎(chǔ)過程，緊密相連。陸地生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)在全球碳收支中占有重要的地位，大約吸收了30%人為排放的碳，是最為有效的自然碳匯[7]。研究陸地碳循環(huán)機(jī)制及其對全球變化的響應(yīng)是預(yù)測大氣CO2 含量及氣候變化的重要基礎(chǔ)。人類活動導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)中氮含量增加[1]，影響土壤和植物體中碳的積累與重新分配，對陸地生態(tài)系統(tǒng)不同碳過程產(chǎn)生不同的影響。

土壤是陸地生態(tài)系統(tǒng)中最大的有機(jī)碳庫，擁有比植被和大氣更多的碳，土壤中碳的微弱變化都會引起大氣中碳的巨大變化，影響陸地生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)和大氣中的碳濃度，并因此對全球的氣候變化產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響[7]。土壤呼吸把植被通過光合作用所固定的碳的14返還到大氣中，是土壤、大氣、植被中碳交換的重要過程，對陸地生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)有巨大的作用[7]。此外，土壤呼吸也是土壤中有機(jī)碳周轉(zhuǎn)的一個重要體現(xiàn)，然而對于氮沉降或人為施肥對土壤呼吸的影響一直沒有確定的結(jié)論。一種觀點認(rèn)為全球碳循環(huán)中所存在的失去的碳庫可能就是由于這種增強(qiáng)的氮沉降對生態(tài)系統(tǒng)固定碳的正反饋作用從而降低土壤呼吸；而另一種觀點認(rèn)為大氣氮沉降會促進(jìn)土壤中的碳分解從而加速土壤呼吸 。通過整合分析了近年陸地生態(tài)系統(tǒng)（森林生態(tài)系統(tǒng)、草地生態(tài)系統(tǒng)和農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)）土壤呼吸對氮素添加的響應(yīng)結(jié)果，并對未來的研究做了展望。

1氮素添加對土壤CO2呼吸的影響

土壤呼吸是生物圈碳循環(huán)的重要組成部分，土壤CO2呼吸大約占到土壤呼吸的34，是地下碳循環(huán)的重要體現(xiàn)。土壤呼吸是根呼吸、土壤動物呼吸、土壤微生物降解和土壤有機(jī)質(zhì)分解產(chǎn)生CO2的生態(tài)學(xué)過程，可分為異養(yǎng)呼吸和自養(yǎng)呼吸。從森林生態(tài)系統(tǒng)、草地生態(tài)系統(tǒng)和農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)分別討論氮素添加對土壤呼吸的影響。

1.1森林生態(tài)系統(tǒng)

森林生態(tài)系統(tǒng)是陸地最大碳儲存庫，所擁有的碳占全球植物碳庫的86%，占全球土壤碳庫的73%。氮素添加對不同森林生態(tài)系統(tǒng)的土壤呼吸有著不同的影響。首先氮施加促進(jìn)了森林生態(tài)系統(tǒng)土壤呼吸，例如對哈佛森林的氮施加試驗得到氮素添加增加了土壤呼吸[8]；對我國華西雨屏區(qū)苦竹林進(jìn)行不同濃度的氮施加試驗都促進(jìn)了土壤呼吸，并且在一定濃度范圍內(nèi)隨施加氮濃度的增加，其促進(jìn)作用也在增強(qiáng)[9]；對加拿大坎貝爾河西南部58年生的花旗松林施氮肥后，在施肥后的最初4個月顯著的增加了土壤呼吸，對土壤的異養(yǎng)呼吸也有增加[10]。其次氮施加也會抑制森林生態(tài)系統(tǒng)的土壤呼吸，例如對森林生態(tài)系統(tǒng)長達(dá)6年的CO2通量的監(jiān)測得出，無機(jī)氮的施入降低了土壤呼吸[11]；對楓樹林模擬大氣氮沉降，除了施氮后的第1年外，施氮都顯著的降低了土壤呼吸[12]；對哈佛森林中的紅松林進(jìn)行長期不同濃度的氮施加降低了土壤呼吸和微生物呼吸[13]；對熱帶森林生態(tài)系統(tǒng)每年施氮肥150 kghm2，試驗進(jìn)行了3年，顯著增加了土壤CO2通量，但實驗室的培養(yǎng)卻得到了相反的結(jié)果[14]；對我國東北地區(qū)落葉松和水曲柳人工林的氮施加試驗也抑制了土壤呼吸[15]。但是也有一些研究結(jié)果得出氮施加對森林生態(tài)系統(tǒng)土壤呼吸沒有影響。近期的整合結(jié)果表明：無論是間歇式高濃度的氮施加或是長期的低濃度的氮施加都會引起森林土壤呼吸尤其是土壤異養(yǎng)呼吸的降低，對于不受氮素限制的森林生態(tài)系統(tǒng)，這種負(fù)作用會更強(qiáng)[16]。

1.2草地生態(tài)系統(tǒng)

草地生態(tài)系統(tǒng)占陸地生態(tài)系統(tǒng)的13，在碳、氮循環(huán)中有重要的地位。氮是大多數(shù)草地生態(tài)系統(tǒng)中的限制性因子，因此，氮素添加會強(qiáng)烈影響到草地生態(tài)系統(tǒng)的土壤呼吸。研究報道，對高寒草地的施肥試驗得出氮素添加增加了土壤呼吸[17]；對溫帶草地進(jìn)行施肥試驗處理后也得到相似的結(jié)果，適度的氮素添加增加了土壤呼吸，尤其是土壤異養(yǎng)呼吸[18]；對東北濕地草地生態(tài)系統(tǒng)的氮素添加研究表明，氮素添加通過增加凋落物的分解速率而增加土壤呼吸[19]；對內(nèi)蒙古溫帶草地進(jìn)行不同濃度的施肥得出，施肥沒有改變土壤呼吸的季節(jié)變化規(guī)律，但卻在施肥后的第1年促進(jìn)了土壤呼吸，同時施肥也改變了土壤呼吸和不同氣候要素之間的關(guān)系，比如增加了土壤呼吸對水分的依賴性，降低了土壤呼吸溫度敏感系數(shù)[20]，相關(guān)的研究還表明，對內(nèi)蒙古高原的荒漠化草原的施肥作用沒有明顯的增加土壤呼吸[21]。

1.3農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)

農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的碳庫是全球碳庫中最活躍的部分之一，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對土壤呼吸的影響巨大。自20世紀(jì)90 年代以來世界各地十分關(guān)注農(nóng)田土壤碳庫變化。 由于農(nóng)田系統(tǒng)操作的復(fù)雜性和受人為因素干擾較多等原因，目前，關(guān)于氮素添加對農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的土壤呼吸的研究并不多。研究結(jié)果報道，美國愛荷華州玉米和大豆輪作土地進(jìn)行4種不同濃度的施肥處理后得到，在種植玉米的時期施肥降低了土壤CO2的排放，在種大豆期施肥對土壤呼吸沒有影響，但實驗室的培養(yǎng)結(jié)果得到氮素添加明顯地降低了土壤CO2排放[22]；對中國河南玉米地進(jìn)行不同濃度的氮施肥試驗得出，氮素添加降低了土壤呼吸，而土壤呼吸在不同濃度間的差異只有在拔節(jié)期才達(dá)到顯著水平[23]，相關(guān)的研究還表明，施加氮肥導(dǎo)致玉米根際呼吸溫度敏感性明顯增強(qiáng)，而土壤基礎(chǔ)呼吸的溫度敏感性則無明顯變化[24]，室內(nèi)相關(guān)的實驗還證明土壤施氮不僅影響土壤呼吸速率和呼吸量，也影響土壤呼吸在各生長階段的分配，還影響到土壤呼吸與溫度的關(guān)系[25]?？傊?，由于農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的復(fù)雜性，關(guān)于氮素添加對土壤呼吸的影響以及其機(jī)理還沒有一致的結(jié)果。

2對土壤呼吸影響的潛在機(jī)制

土壤呼吸是生態(tài)系統(tǒng)的生物、化學(xué)與物理因素共同作用的結(jié)果，不僅受土壤內(nèi)部各因素（溫度、水分、pH、孔隙度等）的影響，更受生物量、凋落物等外部因素的影響。筆者討論了生態(tài)系統(tǒng)的地上地下生物量、凋落物、微生物對外界氮素添加的響應(yīng)及其對土壤呼吸的影響（圖1）。

2.1地上、地下生物量的變化

植物地上地下生物量的變化不僅是植物對外界環(huán)境的響應(yīng)，更能影響到物質(zhì)在生態(tài)系統(tǒng)中的循環(huán)，改變碳在不同生態(tài)系統(tǒng)中的分配，生物量的變化體現(xiàn)了生態(tài)系統(tǒng)所固定的碳，影響到土壤呼吸。氮素添加總體上增加了地上生物量和地下生物量，但相比之下這種增加對地上生物量的分配大于對地下生物量的分配。一方面，氮素添加導(dǎo)致土壤中可利用性氮增加，減少了植株對碳的吸收，這意味著碳的分配會發(fā)生轉(zhuǎn)變，即更多的碳會分配到地上植被組織中；研究表明碳向地下分配的減少對根際土壤呼吸以及土壤CO2通量都有負(fù)作用[26]；土壤可利用性氮的降低會降低土壤呼吸速率，增加土壤中碳的累積[27]；細(xì)根尤其是菌根能夠分泌出大量的可溶性有機(jī)物質(zhì)，這些物質(zhì)是腐生生物的碳源和能源，促進(jìn)了腐生生物對土壤有機(jī)物質(zhì)的分解[28]，氮素添加引起碳向地下分配的減少，阻礙了土壤中有機(jī)物質(zhì)的分解，從而抑制了土壤呼吸。

研究報道，氮添加促進(jìn)了植物組織的周轉(zhuǎn)，如葉和細(xì)根就更能優(yōu)先利用氮，氮添加導(dǎo)致的細(xì)根生長和周轉(zhuǎn)的加速會對因氮施加而導(dǎo)致的碳向地下分配的減少形成負(fù)作用[29]；對濕地生態(tài)系統(tǒng)的氮素添加增加了植被生產(chǎn)力，改善了凋落物，使其易于被分解，因此也就增加了土壤呼吸的底物從而增加了土壤呼吸[30]；模型的結(jié)果得出，氮施肥促進(jìn)了細(xì)根的周轉(zhuǎn)，這也會導(dǎo)致碳向地下分配的增加，氮的增加刺激了碳向地下的分配，從而加速了土壤呼吸，至少會在施肥后的最初幾個月會是這樣[10]。

2.2凋落物

凋落物的分解不僅是陸地生態(tài)系統(tǒng)中營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)的關(guān)鍵過程，更是全球碳循環(huán)的關(guān)鍵組成部分，Raich等[31]估計凋落物的礦化對土壤總碳通量的貢獻(xiàn)大約為70%，因此，凋落物分解的變化在地方、區(qū)域以及全球尺度上都能影響到土壤呼吸甚至碳循環(huán)過程。

氮施加引起的土壤呼吸的變化通過凋落物的分解方式和速率得到解釋。氮素添加會改變凋落物的碳、氮含量，一方面對濕地生態(tài)系統(tǒng)的氮施加增加了凋落物中氮含量，從而降低了凋落物中的碳氮比，加速了凋落物的分解[19]，其他對濕地生態(tài)系統(tǒng)的相關(guān)研究也得到了類似的結(jié)果[32]；另一方面也有研究發(fā)現(xiàn)，凋落物中氮含量在氮施加試驗中并沒有增加，是由于活性氮的增加促進(jìn)了植物的生長從而降低了枯萎組織中氮的含量[33]，Aerts等[34]也發(fā)現(xiàn)氮素添加對凋落物的分解有負(fù)作用。凋落物中氮含量的增加會促進(jìn)凋落物的分解，也有研究表明，向低氮含量的凋落物中增加氮并沒有加速它的分解[35]。即氮施加能夠加速那些產(chǎn)生容易被分解的凋落物的降解，抑制那些不易被分解的凋落物的分解[16]；即氮施加能夠?qū)δ举|(zhì)素含量較低的凋落物的分解起促進(jìn)作用[36]。

此外，不同的施氮濃度也會對凋落物的分解產(chǎn)生影響，Knorr等[36]整合前人的研究報道結(jié)果得出，每年氮施加小于75 kghm2會抑制凋落物的分解（-5%），氮施加在75～125 kghm2會促進(jìn)凋落物的分解（+17%），氮施加大于125 kghm2也會抑制凋落物的分解（-9%）[36]。

2.3微生物

微生物是陸地生態(tài)系統(tǒng)中重要的分解者，對物質(zhì)循環(huán)和能量流動都有巨大的作用。微生物對凋落物和土壤有機(jī)質(zhì)的分解決定著陸地生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)；微生物為維持自己的活性也會消耗物質(zhì)與能量，因此強(qiáng)烈地影響著土壤呼吸。

一方面，氮素添加增加了土壤微生物的呼吸，當(dāng)?shù)獮橐环N限制條件時。這種增加作用是由于土壤中穩(wěn)定群落的微生物活性，或者是由于增加了土壤中微生物的生長。對闊葉林生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行長期氮施肥增加了土壤微生物固定的礦化氮，施氮肥導(dǎo)致了微生物活性和周轉(zhuǎn)的增加[37]。對高山草甸進(jìn)行長期氮施肥試驗得出，施氮促進(jìn)土壤中新形成的有機(jī)質(zhì)的分解，而對比較穩(wěn)定的碳沒有影響，而這種碳分解的機(jī)制是由于微生物的作用[38]；對東北濕地生態(tài)系統(tǒng)的氮素添加研究也得到類似的結(jié)果[19]。

同時，氮素添加也會抑制微生物的活性。已有的研究表明，氮素添加導(dǎo)致的地上凋落物的分解速率降低可歸因于微生物活性降低和生長受限，微生物活性和凋落物的纖維素和木質(zhì)素的分解有關(guān) 。有研究表明，對楓樹林模擬氮沉降后導(dǎo)致的土壤呼吸降低，主要原因為土壤微生物呼吸的降低[12]；對內(nèi)蒙古3種不同類型的草地進(jìn)行施肥處理后抑制了土壤呼吸、氮的礦化和減少了微生物氮含量，這種抑制作用在長期的氮施肥試驗中表現(xiàn)的更為明顯[37]。此外，也有研究得出，氮素添加后的第1個生長季對微生物活性和微生物量都沒有影響[39]，并且土壤呼吸與微生物數(shù)量之間沒有顯著的相關(guān)關(guān)系。

3不足與展望

3.1不同生態(tài)系統(tǒng)對氮沉降響應(yīng)的研究

有關(guān)氮沉降對土壤呼吸的研究絕大部分集中于對森林生態(tài)系統(tǒng)的研究，也有一部分涉及到草地生態(tài)系統(tǒng)和農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)，但對其他生態(tài)系統(tǒng)尤其是一些脆弱生境條件下的生態(tài)系統(tǒng)的研究還較少。如對泥炭地生態(tài)系統(tǒng)，在千年尺度上泥炭地生態(tài)系統(tǒng)因為它的凈初級生產(chǎn)力大于其分解速率而積累了大量的碳，以3%的陸地面積儲存了全球土壤碳的13，在全球變化的背景下成為溫室氣體的重要潛在排放源。對于大多數(shù)泥炭地生態(tài)系統(tǒng)來說都受到氮素的限制而有著比較低的生態(tài)系統(tǒng)凈初級生產(chǎn)力和比較低的凋落物分解速率，然而在氮沉降的基礎(chǔ)上這一系統(tǒng)的凈初級生產(chǎn)力和凋落物分解速率都會有所增加[40]，在氮沉降的作用下這一生態(tài)系統(tǒng)的土壤呼吸極有可能大大增強(qiáng)，甚至使這一系統(tǒng)從碳庫轉(zhuǎn)變成將來的一個重要碳源，然而關(guān)于這一系統(tǒng)的土壤呼吸以及碳循環(huán)還依然未知。對于濕地生態(tài)系統(tǒng)，由于凋落物和土壤有機(jī)質(zhì)的緩慢分解使得濕地生態(tài)系統(tǒng)儲存了大量的有機(jī)碳，氮素添加勢必會對凋落物的分解和土壤呼吸產(chǎn)生強(qiáng)烈的影響。對三江源濕地生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行人工施肥后得出，施肥通過改變凋落物的碳、氮含量和微生物活性從而加速了土壤呼吸，加速了碳排放[19]。不同濕地生態(tài)系統(tǒng)在未來更長時間上如何響應(yīng)全球的氮沉降還依然是未知。對于這類較脆弱的生態(tài)系統(tǒng)，氮沉降的影響或許能超過我們的估計，不僅對土壤中新形成的碳有影響而且也會對土壤中比較老的穩(wěn)定性的碳也產(chǎn)生影響[16]。

3.2氮素添加對土壤呼吸其他氣體的研究

CH4和N2O作為溫室氣體分別于25和298倍CO2的作用，是全球變暖過程中的巨大隱患物質(zhì)，然而，關(guān)于氮沉降對土壤呼吸的研究大多都集中在對土壤CO2呼吸的研究，涉及到N2O和CH4的有對海岸地進(jìn)行氮施肥的研究得出，施氮肥顯著的減少了土壤對CH4的吸收，增加了對N2O的排放，并且對土壤呼吸有持續(xù)弱促進(jìn)的作用；對加拿大坎貝爾河西南部58年生的花旗松林施氮肥后，在第1年顯著的增加了土壤N2O的排放，但在處理后第2年對N2O的釋放沒有任何影響卻有了較弱的吸收，他們總結(jié)到氮施加促進(jìn)了土壤呼吸直到N2O的排放開始下降[10]；對東北濕地生態(tài)系統(tǒng)的氮施加促進(jìn)了地上植物的生長和土壤N2O的排放[41]。灌溉良好的未經(jīng)干擾的生態(tài)系統(tǒng)是大氣CH4的天然庫，能夠固定10%的大氣CH4，溫帶森林土壤是N2O的天然庫，伴隨著全球氮沉降的增加，森林的生產(chǎn)力得到增加這將會對土壤吸收N2O產(chǎn)生巨大的影響，甚至使土壤成為N2O庫源[42]，因為氮施加強(qiáng)烈的影響到了土壤中硝化和反硝化作用[10]。由于CH4和N2O對全球氣候變暖的重要性，為了全面評價全球變化對生態(tài)系統(tǒng)土壤呼吸的影響，需要通過研究確定不同成分土壤呼吸氣體之間是否有著某種相關(guān)性，在應(yīng)對未來氮沉降尤其是加劇的氮沉降時的具體響應(yīng)方式。

3.3氮素添加與其他外界條件的共同作用研究

全球變化背景下的土壤呼吸是多因子的共同作用，例如氣候變暖、CO2濃度增加、降水質(zhì)量和模式的改變以及氮沉降等。近一個世紀(jì)以來，溫度的緩慢升高導(dǎo)致了土壤呼吸的增強(qiáng)，而氮沉降的作用在生態(tài)系統(tǒng)中尤其是森林生態(tài)系統(tǒng)中會導(dǎo)致土壤呼吸的降低，在自然生態(tài)系統(tǒng)中其相互作用共同對陸地生態(tài)系統(tǒng)土壤呼吸產(chǎn)生影響，然而對它們共同作用下陸地生態(tài)系統(tǒng)的響應(yīng)機(jī)制研究知之較少。氮、磷、鉀是生物生長所必須的大量元素，同時也是生態(tài)系統(tǒng)中的限制因素，氮、磷、鉀對土壤呼吸的研究則較少。僅有的研究報道氮、磷、鉀的施加能夠改變土壤溫度和水分從而影響土壤呼吸[40]。

3.4模型

碳、氮相互作用的機(jī)制尚不夠明確，Chen等[43]對Jassal等[42]的實驗的模擬卻得到了相反的結(jié)果，氮素添加引起的碳向地上分配比向地下分配的增多，表明氮的施加并沒有使土壤碳庫發(fā)生很大的變化，因此，陸地生態(tài)系統(tǒng)的模型應(yīng)該綜合考慮到氮素添加導(dǎo)致碳在地上、地下的不同分配，尤其是土壤呼吸所利用到的那部分活性碳的不同分配[44]；碳氮比是體現(xiàn)氮素添加對微生物影響的一個重要指標(biāo)，不同的碳氮比決定不同的微生物活性并因此影響陸地生態(tài)系統(tǒng)中凋落物和土壤有機(jī)質(zhì)的分解速率[45]，因此，將來的模型也應(yīng)該考慮到氮素添加后這一比值的變化對陸地生態(tài)系統(tǒng)土壤呼吸的影響。

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