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隨著基因表達(dá)加帽分析技術(shù)(CAGE),基因表達(dá)序列分析技術(shù)(SAGE)以及cDNA的大規(guī)模平行測(cè)序等高通量技術(shù)方法的發(fā)展,證實(shí)NATs在原核和真核基因組中是普遍存在的。在植物和動(dòng)物基因組中,7%~30%的基因中存在NATs[12](表1)。在人和小鼠轉(zhuǎn)錄基因組中高達(dá)72%的轉(zhuǎn)錄本有反義RNA[10,13]。而且,很多NAT的數(shù)據(jù)庫(kù)也已經(jīng)建立起來(lái)了[4]。NATs長(zhǎng)度通常在100到幾千個(gè)堿基對(duì)。根據(jù)來(lái)源,NATs通?？梢苑譃閮深?lèi):順式NATs(cis-NATs)和反式NATs(trans-NATs)[14]。cis-NATs與trans-NATs的主要區(qū)別在于轉(zhuǎn)錄來(lái)源。cis-NATs轉(zhuǎn)錄自靶基因的基因座的反鏈DNA,而trans-NATs轉(zhuǎn)錄自不同的基因座。因此,cis-NAT與靶基因序列完全互補(bǔ)(二者基因重疊),而trans-NAT由于不完全互補(bǔ)可以作用于許多不同的正義轉(zhuǎn)錄物,形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[15]。cis-NATs最早是在病毒中檢測(cè)到的[16],接著在原核生物[17]以及真核生物[18]中相繼發(fā)現(xiàn)。根據(jù)基因相對(duì)方位和重疊程度,cis-NATs分為頭對(duì)頭(5′到5′)、尾對(duì)尾(3′到3′)、完全重疊以及非重疊NATs[13,19](圖1)。絕大多數(shù)基因組層次上的研究表明:尾對(duì)尾是最普遍的方式[4]。根據(jù)互補(bǔ)區(qū)域的編碼潛能,NATs可以分為編碼—編碼、編碼—非編碼和非編碼—非編碼三類(lèi)[11,14]。

NATs作用方式

NATs在生理以及病理過(guò)程中起重要作用,作用機(jī)理包括:基因組印記(genomicimprinting)、選擇性剪切、X染色體失活、mRNA穩(wěn)定性維持、翻譯調(diào)節(jié)、RNA輸出、DNA甲基化以及組蛋白修飾等[20]?；蚪M印記是一種是由親本來(lái)源不同而導(dǎo)致等位基因表達(dá)差異的一種表遺傳現(xiàn)象。這類(lèi)印記基因約占基因組基因的1%,是哺乳動(dòng)物和顯花植物的獨(dú)特現(xiàn)象。大部分印記基因都分布在印記基因簇內(nèi),其中包含大量的非編碼RNA基因[21]。NATs還參與發(fā)育過(guò)程調(diào)控,對(duì)各種應(yīng)激的適應(yīng)和對(duì)病毒感染的響應(yīng)[22]。NATs通過(guò)直接的反義–正義RNA相互作用,或通過(guò)編碼與正義RNAs共表達(dá)的蛋白來(lái)調(diào)節(jié)正義轉(zhuǎn)錄物,從而調(diào)控正義RNAs的編碼潛能[23]。反義轉(zhuǎn)錄物對(duì)正義轉(zhuǎn)錄物的影響表現(xiàn)在以下兩個(gè)方面[24]:(1)不一致調(diào)節(jié)或反饋調(diào)節(jié),反義轉(zhuǎn)錄物通過(guò)負(fù)性調(diào)節(jié)方式沉默或抑制同源正義RNAs或蛋白質(zhì);(2)一致調(diào)節(jié)或正反饋調(diào)節(jié),正義和反義轉(zhuǎn)錄物共表達(dá),反義轉(zhuǎn)錄物增加了正義RNAs水平或相應(yīng)蛋白質(zhì)水平[25]。

負(fù)反饋調(diào)節(jié)負(fù)反饋調(diào)節(jié)指反義轉(zhuǎn)錄物濃度下降導(dǎo)致正義轉(zhuǎn)錄濃度增加(圖2)。例如在某些情況下為了刺激新生血管形成[26],通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體CD97靶向其編碼的反義配基DDX39最終獲得增強(qiáng)的信號(hào)[4]。P15(CDKN2B)是一個(gè)腫瘤抑制因子,與正常淋巴細(xì)胞相比,白血病淋巴細(xì)胞含有較高濃度的p15反義轉(zhuǎn)錄物,但是p15本身濃度卻很低,提示在白血病中p15與其反義轉(zhuǎn)錄物水平呈負(fù)相關(guān)[25]。這些結(jié)果提示,NATs的上調(diào)也許與腫瘤抑制基因非正常沉默密切相關(guān),NATs可能通過(guò)相似方式又影響了其他基因。

正反饋調(diào)節(jié)正反饋調(diào)節(jié)方式是指:①單獨(dú)靶向反義RNA導(dǎo)致正義mRNA下調(diào);或②反義RNA和正義RNA同時(shí)下調(diào),從而使常規(guī)的正義基因表達(dá)被附帶或協(xié)同下調(diào)(圖2)。轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.2在神經(jīng)干細(xì)胞分化成寡樹(shù)突膠質(zhì)細(xì)胞系中起重要定向作用。研究表明,Nkx2.2的NAT過(guò)表達(dá)促進(jìn)Nkx2.2mRNA水平適度增加,并增強(qiáng)了神經(jīng)干細(xì)胞向寡樹(shù)突膠質(zhì)細(xì)胞系的分化的潛能[27]。參與對(duì)低氧分壓的適應(yīng)的缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)是一個(gè)異二聚體轉(zhuǎn)錄因子,其亞基HIF-1a在非乳頭狀透明細(xì)胞腎腫瘤中高表達(dá),同時(shí)HIF-1a的NAT表達(dá)也上調(diào)[28]。Wrap53是p53的反義轉(zhuǎn)錄RNA,它可以靶向5′非翻譯區(qū),從mRNA和蛋白水平上增加內(nèi)源性p53表達(dá)[29]。Liu等[30]發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)在早期成骨細(xì)胞分化中的NATs,這些NATs增強(qiáng)了干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白5(IFITM5)的表達(dá)和成骨細(xì)胞分化。鑒于這些正反饋調(diào)節(jié),NATs被認(rèn)為可能是一個(gè)潛在的治療多種疾病的藥物靶點(diǎn)。

NATs作用機(jī)制

NATs可能通過(guò)直接的與正義轉(zhuǎn)錄物相互作用,或通過(guò)對(duì)mRNA轉(zhuǎn)錄、突變、運(yùn)輸和翻譯等靶點(diǎn)的影響來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)[20,27]。NATs的調(diào)節(jié)作用以雙鏈RNAs為基礎(chǔ),其作用機(jī)制包括RNA編輯[31]、RNA干擾[32]、RNA封閉[33]和轉(zhuǎn)錄干擾[34]等。在某種生理刺激下,NAT的啟動(dòng)子也有一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)[35],一些NATs和他們相應(yīng)的正義轉(zhuǎn)錄物有可能互相競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合相同的轉(zhuǎn)錄因子,提示NATs和他們的正義轉(zhuǎn)錄物能共表達(dá)或成反比表達(dá)[36]。此外,DNA甲基化和/或組蛋白修飾也參與了基因表達(dá)調(diào)節(jié)[37]。因此,NATs與DNA甲基化和組蛋白修飾之間可能存在直接的聯(lián)系。

RNA編輯靶向核編碼RNA和病毒RNA雙鏈區(qū)域的腺嘌呤脫氨酶(ADARs)是一類(lèi)RNA編輯酶。這些酶在神經(jīng)系統(tǒng)中含量豐富,可通過(guò)改變mRNA中的密碼子,使基因組中編碼信息多樣化。ADARs在已知底物中的功能提示這些酶通過(guò)多種方式微調(diào)和優(yōu)化很多生物通路。

RNA干擾反義RNA能夠影響mRNA生物轉(zhuǎn)化的最早期過(guò)程,包括調(diào)控染色體結(jié)構(gòu),轉(zhuǎn)錄起始和剪切等。在血管平滑肌細(xì)胞中,RNA干擾介導(dǎo)的一氧化氮合酶反義mRNA(sONE)的下調(diào)增加了內(nèi)源性一氧化氮合酶(eNOS)的表達(dá)。內(nèi)皮細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)的sONE削弱了eNOS表達(dá)。結(jié)果提示,sONE參與了轉(zhuǎn)錄后eNOS的調(diào)節(jié)[27]。

RNA封閉RNA封閉就是由于反義RNA與正義RNA配對(duì)形成雙鏈,封閉了正義轉(zhuǎn)錄物(pre-mRNA)的剪切位點(diǎn),使pre-mRNA發(fā)生選擇性剪接改變,或抑制了反式作用因子與pre-mRNA結(jié)合,最終導(dǎo)致靶mRNA運(yùn)輸、翻譯抑制或降解。

轉(zhuǎn)錄干擾轉(zhuǎn)錄干擾是由于NATs在轉(zhuǎn)錄時(shí),正義—反義RNAs雙鏈(dsRNAs)上的兩個(gè)RNA聚合酶Ⅱ發(fā)生聚集碰撞而引起的。在簡(jiǎn)單的真核生物中,例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),在基因及其調(diào)控元件之間由于相互擠壓碰撞而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄干擾是不可避免的[34]。

DNA甲基化DNA甲基化發(fā)生在CpG島,并且通過(guò)頭甲基化酶(DNMTs),例如DNMT3A和DNMT3B來(lái)甲基化[38]。Dnmt1以半甲基化DNA為底物來(lái)維持DNA甲基化。腫瘤的表觀遺傳標(biāo)志物在總體基因組DNA中低甲基化,而在腫瘤抑癌基因中超甲基化[39]。但是,起始和協(xié)助DNA甲基化的機(jī)制還很不清楚。Imamura等[40]報(bào)道鞘氨醇激酶1(Sphk1)的NAT過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)CpG島去甲基化,而在正義鏈3′非CpG位點(diǎn)重新甲基化。在遺傳性地中海貧血中血紅蛋白a2(HBA2)能指導(dǎo)CpG島甲基化[41]。NAT介導(dǎo)的CG去甲基化和非CG甲基化提示這可能是表觀遺傳的一個(gè)新機(jī)制[10]。

組蛋白修飾組蛋白修飾包括甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化、小泛素相關(guān)修飾和糖基化。不同修飾方式相結(jié)合導(dǎo)致基因活化或基因抑制[42-43]。組蛋白乙酰化和甲基化也許對(duì)DNA修復(fù)和基因轉(zhuǎn)錄有直接的影響。通常,組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(HACs)和組蛋白去乙酰基轉(zhuǎn)移酶(HDACs)介導(dǎo)的組蛋白乙?；且粋€(gè)基因活化的標(biāo)志[39,44]。組蛋白甲基化由組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶和去甲基化轉(zhuǎn)移酶調(diào)節(jié)。組蛋白H3第4位賴(lài)氨酸(H3K4)的單、雙和三甲基化與轉(zhuǎn)錄活化密切相關(guān),然而組蛋白H3第9位賴(lài)氨酸(H3K9)的雙和三甲基化與轉(zhuǎn)錄抑制密切相關(guān)[45]。而且,組蛋白H3第20位賴(lài)氨酸甲基化與轉(zhuǎn)錄也密切相關(guān)[46]。Xist基因與X染色體失活有著密切關(guān)系,在啟動(dòng)子區(qū)域,Xist基因反義轉(zhuǎn)錄物Tsix通過(guò)募集組蛋白修飾蛋白復(fù)合物可以使Xist失活[47]。在H3K4細(xì)胞中P15的反義轉(zhuǎn)錄物通過(guò)增加H3K9的二甲基化和減少H3K4二甲基化來(lái)下調(diào)P15。在啟動(dòng)子區(qū),正義和反義轉(zhuǎn)錄物之間的雙向結(jié)構(gòu)的形成可能直接或間接的促進(jìn)或抑制組蛋白–修飾蛋白復(fù)合物的結(jié)合。因此,NATs和組蛋白修飾之間的相互作用也為表觀遺傳學(xué)提供了新的機(jī)制。NATs和DNA甲基化,NATs和組蛋白修飾以及DNA甲基化與組蛋白修飾之間的密切關(guān)系均已被發(fā)現(xiàn)。在基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的超甲基化引起了局部組蛋白的去乙?；?。H3K4的去甲基化與啟動(dòng)子甲基化相關(guān),然而低乙酰化誘導(dǎo)了DNA甲基化[48]。因此,在基因調(diào)節(jié)過(guò)程中,不同種類(lèi)的表觀遺傳修飾緊密聯(lián)系而且協(xié)同作用。

NATs與疾病

NATs與腫瘤據(jù)報(bào)道在腫瘤中,大部分基因組發(fā)生了去甲基化,轉(zhuǎn)錄噪音增加可能引起反義轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生,反義轉(zhuǎn)錄物進(jìn)而影響關(guān)鍵抑癌基因功能,最終導(dǎo)致腫瘤惡性轉(zhuǎn)化。Orfanelli等[49]在黑素瘤TRPM2位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)一種新型的正義TRPM2-TE和反義轉(zhuǎn)錄物TRPM2-AS。在黑素瘤中TRPM2-TE和TRPM2-AS表達(dá)上調(diào),而且他們的活化與CpG島甲基化狀態(tài)有關(guān)。TRPM2-TE敲除和野生型TRPM2一樣增加了黑素瘤對(duì)凋亡和壞死的易感性。缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)的一個(gè)反義轉(zhuǎn)錄物aHIF已經(jīng)被證明在正常人組織中廣泛表達(dá)[50],在腎癌中由于vhl基因突變引起aHIF永久性的過(guò)表達(dá)[28]。此外,在乳腺癌中aHIF過(guò)表達(dá),且aHIF表達(dá)水平與腫瘤預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[28,51]。在永生化的淋巴細(xì)胞系中低氧可以誘導(dǎo)aHIF產(chǎn)生[28],表明HIF-1的反義轉(zhuǎn)錄物aHIF與HIF-1a共同參與了代謝調(diào)控通路。Survivin是一個(gè)新型的凋亡抑制劑,在腫瘤細(xì)胞中表達(dá),而在正常成熟組織中不表達(dá),被認(rèn)為是一種很有潛力的抗腫瘤治療的靶點(diǎn)。在一種人來(lái)源的結(jié)腸癌細(xì)胞系中,誘導(dǎo)survivin的一個(gè)NATs效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體(EPR-1),導(dǎo)致survivin表達(dá)下調(diào),同時(shí)引起細(xì)胞增殖減慢,凋亡增加,對(duì)抗腫瘤制劑敏感性也增加。此外,EPR-1可使皮下腫瘤尺寸顯著減小,如果與抗腫瘤藥物聯(lián)合使用這種效應(yīng)會(huì)增強(qiáng)。這些結(jié)果提示,通過(guò)誘導(dǎo)EPR-1cDNA來(lái)調(diào)節(jié)survivin也許是一種非常有潛力的治療結(jié)腸癌的方法[52]。Ca-paccioli等[53]發(fā)現(xiàn)了一個(gè)bcl-2/IgH的反義轉(zhuǎn)錄物下調(diào)了人濾泡淋巴瘤細(xì)胞系t(14;18)DOHH2中bcl-2基因表達(dá)。

NATs與人類(lèi)其它疾病與目前廣泛應(yīng)用的沉默基因或改造在mRNA剪接方式等方法相比,體內(nèi)特異性基因的上調(diào)是基因治療的可望而不可及的目標(biāo)。Modarresi[54]及其同事成功上調(diào)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)表達(dá)。他們通過(guò)抑制BDNF的一個(gè)NAT來(lái)阻斷寡核苷酸向小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的運(yùn)輸,從而抑制了BDNF水平,這將是大量神經(jīng)退行性疾病治療的一個(gè)重要靶點(diǎn),如果采用小分子或microRNA抑制劑,有可能導(dǎo)致不相干基因活化。亨丁頓舞蹈癥(Huntington’sdisease,HD)是一種漸進(jìn)性的神經(jīng)退化疾病,是由亨丁頓(HTT)基因外顯子的一個(gè)CAG重復(fù)擴(kuò)增而引起。Chung等[55]鑒定出HTT反義RNA(HTTAS),即一個(gè)在HD重復(fù)序列位點(diǎn)的NAT,HTTAS從4個(gè)選擇性位的起始轉(zhuǎn)錄,在HD大腦組織中發(fā)現(xiàn)2個(gè)HTTAS剪切異構(gòu)體。幾乎所有的人類(lèi)遺傳疾病均是由于個(gè)別幾個(gè)相關(guān)基因或調(diào)控序列的突變而引起的。Tufarelli等[56]研究發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)基因模型小鼠以及分化的干細(xì)胞中,RNA反義轉(zhuǎn)錄物介導(dǎo)相關(guān)CpG島的沉默和甲基化。這些發(fā)現(xiàn)提出了一個(gè)人類(lèi)遺傳性疾病發(fā)生的新機(jī)制。

總結(jié)與展望

綜上所述,哺乳動(dòng)物NATs的主要特點(diǎn)如下[24]:(1)NATs比以前假設(shè)的種類(lèi)更多;(2)NATs代表一種基因調(diào)節(jié)現(xiàn)象;(3)NATs更普遍的是代表非編碼RNA;(4)NATs以順式(與相應(yīng)正義轉(zhuǎn)錄物在相同位點(diǎn))或反式(與相應(yīng)正義轉(zhuǎn)錄物相隔一段距離)形式出現(xiàn);(5)只有很少數(shù)NATs功能被注釋;(6)有一些NAT參與生理或病理功能調(diào)節(jié);(7)NAT可能是一類(lèi)潛在的新興藥物靶點(diǎn),可以使正義基因和/或轉(zhuǎn)錄物上調(diào)或下調(diào)。NATs是一類(lèi)調(diào)節(jié)RNAs,在mRNA和/或蛋白水平上,對(duì)正義轉(zhuǎn)錄物起重要調(diào)節(jié)作用[8]。通過(guò)正義—反義雙向結(jié)構(gòu)的形成,NAT以正反饋或負(fù)反饋方式調(diào)節(jié)正義轉(zhuǎn)錄物。在正反饋調(diào)節(jié)中,通過(guò)上調(diào)腫瘤抑制基因NATs來(lái)再活化異常沉默的腫瘤抑制基因。相反,在正反饋調(diào)節(jié)中,過(guò)度表達(dá)的原癌基因可以被下調(diào)的NATs沉默。對(duì)不能耐受化療藥物毒性的患者來(lái)說(shuō),NATs可能是另一種新型的治療方法。而且,在腫瘤組織中NATs的表達(dá)水平與正常組中不同。因此,NATs可以作為監(jiān)測(cè)腫瘤發(fā)展的分子標(biāo)志物。表觀遺傳的改變是可逆的,并且在疾病的發(fā)生和發(fā)展中逐漸引起了重視。表觀遺傳治療也被認(rèn)為是最有前景的治療方法之一[57]。最近,兩類(lèi)抑制DNA甲基化或組蛋白乙?；谋碛^遺傳藥物已經(jīng)被研制,包括DNMT抑制劑(例如,5-氮雜胞苷和地西他濱),HDACs抑制劑(曲古菌素A,異羥肟酸),部分藥物已經(jīng)應(yīng)用與臨床[58-59]。但最近研究表明,一些患者不能耐受藥物毒性。因此,探尋其他有前景的藥物是必須的。調(diào)節(jié)RNAs在表觀遺傳過(guò)程中起重要作用,這為藥物設(shè)計(jì)策略提供了新的未來(lái)。很多調(diào)節(jié)RNAs對(duì)蛋白編碼基因敏感[60]。

自從最初直接將反義轉(zhuǎn)錄物作為新興藥物候選靶點(diǎn)迄今已20余年了,很多研究相繼采用小分子、反義寡核苷酸、核酶或寡核苷酸適配子等,重點(diǎn)瞄準(zhǔn)mRNAs。在歐洲一些反義藥物已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。福米韋生(Vitravene)是第一個(gè)被美國(guó)FDA批準(zhǔn)的反義藥物,用于艾滋病人視網(wǎng)膜炎的治療[61]。G3139是Bcl-2的反義寡核苷酸,能從mRNA和蛋白水平上下調(diào)Bcl-2表達(dá)。G3139已經(jīng)應(yīng)用于人類(lèi)疾病臨床三期試驗(yàn)[62]。NATs是細(xì)胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)錄物,且廣泛存在,不僅以有效的和特異的方式調(diào)節(jié)其相應(yīng)關(guān)正義轉(zhuǎn)錄物而且副作用小,在體內(nèi)幾乎沒(méi)有毒性。NATs可能是一種豐富的生物分子資源,可用于表觀遺傳學(xué),在未來(lái)有潛在的診斷和治療價(jià)值[60]。

作者：騫愛(ài)榮李迪杰商澎單位：西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院,西北工業(yè)大學(xué)特殊環(huán)境生物物理學(xué)研究所空間生物實(shí)驗(yàn)?zāi)M技術(shù)國(guó)防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室