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【摘要】目的探討人工合成的CpGODN對(duì)不同物種的免疫刺激活性，開(kāi)發(fā)具有廣譜免疫刺激活性的CpGODN。方法將特定的CpGODN單獨(dú)或與不同的抗原聯(lián)合分別免疫雞和小鼠，用ELISA檢測(cè)不同時(shí)間雞和小鼠特異性抗體的滴度。結(jié)果CpGODN均能誘導(dǎo)雞和小鼠產(chǎn)生抗原特異性抗體，且抗體水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論這種CpGODN在一定程度上具有廣譜免疫刺激特性。

【關(guān)鍵詞】CpGODN；種屬特異性；疫苗

Abstract:ObjectiveToinvestigatetheimmunestimulationactivityofCpGoligodeoxynucleotidestodifferentspeciesanddevelopCpGoligodeoxynucleotidesthatpossessbroad-spectrumimmunestimulationactivity.MethodChickensandmicewererespectivelyvaccinatedwithCpGoligodeoxynucleotidesorsynergisticallywithdifferentantigens,andthentitersofspecificantibodyinthebloodserumsofchickensandmiceweredetectedwithELISA.ResultsCpGoligodeoxynucleotidescouldinducethegenerationofantigenspecificantibodyinchickensandmice,andthelevelofantibodiesingroupswhichuseCpGODNasadjuvantishigherthanthatinthecontrolgroup(P<0.05).ConclusionCpGODNthatwemaderestrictivelypossessesbroad-spectrumimmunestimulationactivity.

Keywords:CpGODN；multispeciesspecificity；vaccine

包含CpG基序的人工合成的寡核苷酸（ODN）作為免疫刺激信號(hào)可以被動(dòng)物的免疫系統(tǒng)所識(shí)別，隨后CpGODN刺激人類(lèi)和多種動(dòng)物產(chǎn)生天然的和獲得性的免疫應(yīng)答。CpGODN主要通過(guò)TLR9活化免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答。因此，CpGODN作為佐劑已廣泛應(yīng)用于感染性疾病、腫瘤的預(yù)防和治療［1］。但CpGODN存在種屬特異性問(wèn)題，這一問(wèn)題限制了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)論的外推性［2］。所以，尋找和開(kāi)發(fā)具有廣譜識(shí)別特性的CpGODN具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本文主要通過(guò)觀察雞和小鼠血清中特異性抗體的變化來(lái)評(píng)價(jià)CpGODN對(duì)不同抗原的免疫增強(qiáng)效果，進(jìn)而確定這種CpGODN是否能夠克服物種限制性這一問(wèn)題。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物健康1日齡小雞，健康50日齡SPF雞，購(gòu)自廣東省農(nóng)科院；2月齡BALB/c小鼠,雌性,體質(zhì)量20g左右，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：2003A074。

1.1.2試劑10mg/mL豬囊蟲(chóng)抗原、豬囊尾蚴DNA疫苗VTS76、VR1020、CpGODN由本實(shí)驗(yàn)室保存［3,4］，SPAHRP購(gòu)自上海生物制品研究所。

1.2動(dòng)物分組及免疫方案

1.2.1雞實(shí)驗(yàn)組取健康1日齡小雞，隨機(jī)分成A、B、C三個(gè)組，每組20只，各組飼養(yǎng)條件相同。7日齡時(shí)各組處理如下：A為對(duì)照組，不作任何處理；B組滴鼻免疫VTS76疫苗（100μg/kg）；C組滴鼻免疫VTS76疫苗（100μg/kg）,并同時(shí)頸部皮下注射免疫佐劑CpGODN（100μg/kg），21日齡時(shí)B、C組按相同的處理加強(qiáng)免疫1次。

1.2.2BALB/c小鼠實(shí)驗(yàn)組BALB/c小鼠60只,隨機(jī)分為3組,每組間隔2周免疫2次。采用肌肉注射法,將質(zhì)粒DNA溶液注射到小鼠兩側(cè)股四頭肌。A組注射VR1020100μg/kg作為陰性對(duì)照;B組注射VTS76（100μg/kg）;C組注射VTS76和CpGODN各100μg/kg。

1.3抗原特異性抗體檢測(cè)96孔培養(yǎng)板用碳酸氫鈉緩沖液(15mmol/LNa2CO3,35mmol/LNaHCO3,PH9.6)適當(dāng)稀釋的豬囊蟲(chóng)抗原包被，4℃過(guò)夜孵育。用含Tween20的PBS(0.1mol/LPBS，0.1%Tween20)洗滌3次，每次3min；每孔加入100mL經(jīng)PBS(0.1mol/LPBS，1%BSA)適當(dāng)稀釋的待測(cè)血清，37℃孵育2h。PBS洗滌5次，每孔加入100mL、1∶40稀釋的SPAHRP，37°C孵育2h。PBS洗滌5次，每孔加入100mLTMB底物（含0.1mg/mL3’3’5’5’四甲基聯(lián)苯胺的磷酸鹽檸檬酸緩沖液，pH5.4，用前加5mL30%H2O210mL），37℃孵育1h。每孔加入50mLH2SO4(0.2mol/L)終止顯色反應(yīng)。BioRad3550測(cè)定A450讀數(shù)。待測(cè)樣品A值大于陰性對(duì)照平均A值的3倍為陽(yáng)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)比較均采用方差分析，P<0.05為差異有顯著性。

2結(jié)果

2.1CpGODN對(duì)雞血清中豬囊尾蚴特異性抗體滴度的影響C組在初次免疫1周后可以檢測(cè)到特異性抗體，但抗體滴度很低；在初次免疫2周和二次免疫1周后，B組和C組特異性抗體滴度明顯上升，且C組顯著高于B組(P<0.05)；二次免疫后2周，B組還有明顯上升，而C組已進(jìn)入平臺(tái)期，維持在一個(gè)較高的水平，兩組之間差異無(wú)顯著性(P>0.05)。對(duì)照A組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均未檢測(cè)到特異性抗體。以上結(jié)果表明，CpGODN能夠顯著增強(qiáng)VTS76疫苗誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答水平。見(jiàn)圖1。

圖1免疫雞特異性抗體滴度的動(dòng)態(tài)變化（略）

Fig.1Dynamicchangesoftitersofspecificantibodyagainstofimmunizedchickens

2.2CpGODN對(duì)小鼠血清中豬囊尾蚴特異性抗體滴度的影響B(tài)組和C組在初次免疫1周后可以檢測(cè)到特異性抗體，但抗體滴度很低(1∶20)。二次免疫后1周，B組和C組免疫小鼠的抗體滴度均明顯上升，但差異無(wú)顯著性(P>0.05)。二次免疫后的第2周到第3周，C組的特異性抗體滴度明顯高于B組(P<0.05)。對(duì)照A組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均未檢測(cè)到特異性抗體。結(jié)果表明，CpGODN能夠顯著提高豬囊尾蚴DNA疫苗的體液免疫應(yīng)答水平。見(jiàn)圖2。

圖2免疫小鼠特異性抗體滴度的動(dòng)態(tài)變化（略）

Fig.2Dynamicchangesoftitersofspecificantibodyofimmunizedmice

3討論

CpGODN的種屬特異性是指特定序列的CpGODN僅對(duì)特定種屬的免疫細(xì)胞具有免疫刺激活性。早期研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)人類(lèi)TLR9產(chǎn)生最佳刺激效果的CpG基序是GTCGTT，而對(duì)小鼠TLR9最佳的CpG基序是GACGTT。將對(duì)人免疫細(xì)胞具有強(qiáng)刺激活性的ODN作用于鼠的免疫細(xì)胞時(shí)，僅顯示出很弱的免疫活性，甚至無(wú)免疫活性，反之亦然［5］。CpGODN的種屬特異性與TLR9的有效識(shí)別有關(guān)，即特定種群的TLR9僅識(shí)別特異的CpGODN序列。研究還發(fā)現(xiàn)，TLR9單個(gè)氨基酸的改變都會(huì)影響CpGODN的免疫刺激效果［6］。

目前，對(duì)于TLR9對(duì)ODN的識(shí)別方面有了更深入的認(rèn)識(shí)。由于天然的磷酸二酯(PD)修飾ODN易于降解，所以目前應(yīng)用較多的CpGODN均為磷硫酰（PS）修飾的ODN。而TaraLR［7］認(rèn)為T(mén)LR9識(shí)別CpG基序的物種特異性?xún)H限定于磷硫酰（PS）修飾的ODN，而天然的磷酸二酯骨架卻不受影響。因此，人類(lèi)和小鼠的細(xì)胞并沒(méi)有進(jìn)化到可以識(shí)別天然DNA中不同的CpG基序。我們采用的CpGODN是將60bp磷酸二酯（PD）修飾的ODN與pUC18載體體外連接，構(gòu)建為重組質(zhì)粒pUC18ODNs。這種磷酸二酯（PD）修飾的ODN可能更真實(shí)地模擬天然的包含CpG基序的非甲基化的ODN，克服TLR9識(shí)別CpG基序的物種特異性，從而提高自身對(duì)多種屬的免疫刺激活性。

KandimallaER［8］設(shè)計(jì)了一種具有潛在的免疫刺激活性并能克服物種特異性識(shí)別效應(yīng)的二核苷酸基序RpG。包含GARGTT和GTRGTT基序的ODN能夠活化J774細(xì)胞的NFκB通路，同時(shí)誘導(dǎo)小鼠和人類(lèi)細(xì)胞分泌大致相等水平的細(xì)胞因子。與CpGODN相比，RpGODN能夠同時(shí)被HEK293細(xì)胞中的小鼠TLR9所識(shí)別。該種RpGODN還能誘導(dǎo)其它多個(gè)物種的外周血單個(gè)核細(xì)胞的增殖。此研究揭示了我們可以通過(guò)對(duì)寡核苷酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造或修飾繞過(guò)TLR9識(shí)別的物種限制性，達(dá)到誘導(dǎo)多種屬產(chǎn)生免疫應(yīng)答的目的。

本研究結(jié)果表明，本研究所制備的CpGODN能夠同時(shí)提高雞和小鼠的體液免疫應(yīng)答水平，這一研究結(jié)果為開(kāi)發(fā)具有廣譜免疫識(shí)別特性的CpGODN提供了重要的線(xiàn)索。當(dāng)然，目前的研究還有待進(jìn)一步深入，包括擴(kuò)大物種的實(shí)驗(yàn)范圍（特別是哺乳動(dòng)物），同時(shí)研究體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。

【參考文獻(xiàn)】

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