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【關鍵詞】肝腫瘤;放射療法;抗VEGF單抗;放射增敏

Radiosensibilityofhumanhepatocellularcarcinomaxenograftsenhancedbyantivascularendothelialgrowthfactormonoclonalantibody

【Abstract】AIM:Toinvestigatetheinhibitingeffectsofcombiningantivascularendothelialgrowthfactor(VEGF)monoclonalantibody(mAb)therapywithradiotherapyonthegrowthofhepatocellularcarcinomaxenograftsinvivo.METHODS:Humanhepatocellularcarcinomacellline,SMMC7721,wasimplantedscinmice.Themicewithxenograftsweredividedinto4groups,radiation(RT)20Gygroup,RT20GyplusmAbgroup,RT30GyplusmAbgroupandcontrolgroup.AntiVEGFmAbwasinjectediponalternatedaysforatotalof6injectionsatadosageof50μg/mouse.Singleradiationdosesweregiven24hafterthe4thinjectionofmAb.Tumordiametersweremeasuredandtumorvolumewascalculated.Miceweresacrificed2wkafterthe6thinjectionandtheintratumoralmicrovesseldensitywasdeterminedbycountingthestainedvesselswithimmunohistochemistry.RESULTS:Radiationsignificantlyreducedthegrowthandthemicrovesseldensityoftumors.TheinhibitoryeffectsweremoresignificantwhenradiationwascombinedwithantiVEGFmAb,andRT30GyplusmAbwasmoreeffectivethanRT20GyplusmAb.ForRT20Gygroup,RT20GyplusmAbgroupandRT30GyplusmAbgroup,theinhibitoryratesoftumorweightwere75.3%,83.9%and94.7%,respectively.CONCLUSION:AntiVEGFmAbenhancestheradiosensibilityofhumanhepatocellularcarcinomaxenografts.Thestrategyisoneoftheapproachesforhepatocellularcarcinomatreatment.

【Keywords】hepatocellularcarcinoma;radiotherapy;antiVEGFmAb;radiosensibility

【摘要】目的:觀察抗血管內皮生長因子抗體(VEGFmAb)與不同劑量放射聯(lián)合對肝癌裸鼠移植瘤生長的抑制作用.方法:將SMMC7721肝癌細胞種植于裸鼠皮下,成瘤動物分為單純放射20Gy組、放射20Gy+抗體組、放射30Gy+抗體組和對照組,腹腔給予抗VEGFmAb50μg/只，隔日1次,共6次,放射劑量一次性給予.測量腫瘤直徑并計算瘤體積,抗體給藥結束后2wk處死動物,免疫組化法測腫瘤微血管密度(MVD).結果:放射能抑制腫瘤生長,減少腫瘤MVD,放射與抗體結合對腫瘤生長的抑制作用更顯著，且放射30Gy+抗體比放射20Gy+抗體效果更好.單純放射20Gy組、放射20Gy+抗體組和放射30Gy+抗體組的瘤質量抑制率分別為75.3%,83.9%和94.7%,差異有統(tǒng)計學意義.結論:抗VEGFmAb對放射治療肝癌移植瘤有增敏作用,是肝癌綜合治療的有效途徑之一.

【關鍵詞】肝腫瘤;放射療法;抗VEGF單抗;放射增敏

0引言

放射治療腫瘤的目的是盡可能提高腫瘤的放射劑量以殺滅瘤細胞,但同時正常組織和器官所受輻射量也相應提高,增加了放射治療的副反應,因而限制了通過提高放射劑量來控制腫瘤的作用.肝癌是放射欠敏感腫瘤,而正常肝組織對放射線較敏感.單純放射治療肝癌的療效并不理想［1］.有報道［2］抗血管內皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)抗體可以抑制肝癌裸鼠移植瘤生長,我們觀察抗VEGFmAb與不同放射劑量聯(lián)合對肝癌移植瘤生長的抑制作用,以了解兩者聯(lián)合應用的機制與方法.

1材料和方法

1.1材料Balb/cnu/nu小鼠20只(南方醫(yī)科大學實驗動物中心),5～6wk齡,雄性,體質量19.0～22.0g,SPF層流柜分籠飼養(yǎng);SMMC7721人肝癌細胞株（武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心）;MonoclonalantiVEGFantibody,producedinmouse,clone26503.11（Sigma公司）;培養(yǎng)箱（37℃,50mL/LCO2）,倒置顯微鏡(XDP1,上海光學儀器廠),Varian23EX醫(yī)用直線加速器（美國）,RPMI1640細胞培養(yǎng)液（含100mL/L胎牛血清,青霉素1×105U/g,鏈霉素100mg/L）,胰蛋白酶,免疫組化SABC法相關試劑（武漢博士德公司）.

1.2方法

1.2.1癌細胞培養(yǎng)SMMC7721人肝癌細胞株于25mL培養(yǎng)瓶中繁殖傳代,細胞貼壁長滿瓶壁后移入250mL培養(yǎng)瓶繼續(xù)傳代繁殖,取指數生長期細胞胰酶消化,2000r/min離心2min,收集細胞用生理鹽水懸浮,顯微鏡下以細胞計數板計算細胞密度,生理鹽水定容細胞密度為2×1010/L.

1.2.2癌細胞種植參考文獻［3］方法,裸鼠于飼養(yǎng)環(huán)境適應1d后種植癌細胞,取裸鼠右后肢大腿外側皮下為種植點,1mL注射器抽取0.2mL細胞懸液（含4×106個細胞）注入種植點皮下.

1.2.3動物分組及腫瘤生長觀察腫瘤種植后1wk,可觀察到全部動物有明顯皮下腫塊形成,第10日腫塊直徑約5mm.將動物隨機分為4組,即單純放射20Gy組、放射20Gy+抗體組、放射30Gy+抗體組和對照組,每組5只.用游標卡尺測量腫塊長徑（a）及橫徑（b）,隔日測量1次,腫瘤體積(V)=a×b2/2.

1.2.4抗體給予及放射治療以0.2μm針式濾器過濾除菌的PBS液溶解抗VEGFmAb至100mg/L,于腫瘤種植后10d分組后腹腔注射抗VEGFmAb,50μg/只,隔日1次,共6次.單純放射組及對照組同樣途徑給予等體積量PBS.第4次給予抗VEGFmAb后的第2日行放射治療,放療機房紫外線消毒,受照動物四肢以細繩固定在小木板上,照射野大小3cm×3cm,源皮距100cm,6MeV電子線,劑量率4Gy/min,單純放射組劑量20Gy,放射+抗體組劑量分別為20Gy和30Gy,全部放射劑量一次性給予.

1.2.5瘤體稱質量抗體給藥結束后繼續(xù)觀察腫瘤生長2wk,于腫瘤種植后34d處死動物,仔細分離腫塊周邊皮膚及非腫瘤組織,瘤體稱質量,瘤質量抑制率(%)=（1－實驗組平均瘤質量/對照組平均瘤質量）×100.

1.2.6免疫組化微血管密度(MVD)測定將腫瘤組織切成3mm厚片狀,40g/L甲醛固定24h,脫水石蠟包埋,切片厚5μm.免疫組化SABC法:一抗為多克隆兔抗鼠CD34抗體,工作濃度1∶100稀釋.即用型HighSABC免疫組化試劑盒,具體操作按試劑盒說明進行,DAB染色,蘇木素復染,樹膠封片.選血管內皮細胞染色密集區(qū)于高倍鏡(×200)下計數染色細胞,每片計數5個視野取平均值.

統(tǒng)計學處理SPSS10.0統(tǒng)計分析軟件,應用重復測量數據方差分析處理腫瘤體積變化數據,多個獨立樣本非參數檢驗處理瘤質量抑制數據和MVD數據,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義.

2結果

2.1放射和抗VEGFmAb對腫瘤生長的抑制作用SMMC7721人肝癌細胞培養(yǎng)時增殖及傳代能力強,裸鼠皮下種植成瘤率高,20只動物全部成瘤.種瘤后10d動物分組時各組腫瘤體積無顯著性差異,放射治療前給予抗體4次,腫瘤生長呈現減慢趨勢,但與非抗體組差異不顯著.放射治療后,單純放射組及放射20Gy+抗體組腫瘤仍緩慢生長,但放射30Gy+抗體組腫瘤生長完全被抑制,腫瘤縮小.種瘤后20d單純放射組、放射20Gy+抗體組和放射30Gy+抗體組腫瘤體積顯著小于對照組,且放射與抗體聯(lián)合組優(yōu)于單純放射組,此顯著性差異一直持續(xù)至動物處死(種瘤后34d),放射30Gy+抗體組腫瘤體積小于放射20Gy+抗體組（表1）.

表1放射和抗VEGFmAb對腫瘤生長的抑制作用(略)

bP＜0.01vs對照組;cP＜0.05vs單純放射組;eP＜0.05vs放射20Gy+抗體組.

2.2瘤質量抑制率和MVD單純放射組、放射20Gy+抗體組和放射30Gy+抗體組在動物處死時的瘤質量抑制率分別為75.3%,83.9%和94.7%,均有明顯抑制腫瘤質量增長作用.放射30Gy+抗體組瘤質量明顯低于單純放射組和放射20Gy+抗體組.各處理組MVD低于對照組,放射與抗體聯(lián)合較單純放射組MVD低,MVD在放射20Gy+抗體組與放射30Gy+抗體組之間差異無統(tǒng)計學意義(表2).

表2瘤質量抑制率與微血管密度(略)

bP＜0.001vs對照組;cP＜0.05vs單純放射組;eP＜0.05vs放射20Gy+抗體組.

3討論

SMMC7721肝癌裸鼠移植瘤細胞的形態(tài)和結構與人肝癌細胞特性類似［3］,移植瘤生長迅速,未經治療的腫瘤生長速度快,單純放射治療能延緩其生長速度,聯(lián)合抗VEGFmAb后抑制腫瘤生長效果更明顯,但單純放射或放射20Gy加抗體組腫瘤仍呈逐漸加速的生長趨勢.雖然放射和抗VEGFmAb均能抑制肝癌移植瘤生長,但實驗結果顯示放射30Gy加抗體是較好的聯(lián)用方式,瘤體生長停滯并有縮小,對瘤質量和瘤體積的抑制都優(yōu)于低劑量放射組.

放射是以腫瘤細胞為靶點的治療措施,通過對腫瘤細胞的殺滅來控制其生長.放射在殺滅瘤細胞的同時又誘導腫瘤細胞表達VEGF升高,保護血管內皮細胞抗拒放射線攻擊,促進腫瘤血管形成［4］;或通過提高腫瘤細胞基質分解酶活性,增強瘤細胞的侵襲力［5］,因而放射誘導了腫瘤的保護機制,降低瘤細胞對放射線的敏感性.抗VEGFmAb抑制VEGF的表達和血管形成,使腫瘤賴以生長及轉移的血管形成不足,本身具有抗腫瘤作用;又能通過降低VEGF表達使血管內皮細胞失去免受放射線攻擊的保護,增強瘤細胞的放射敏感性,因而抗VEGFmAb與放射起到了協(xié)同抑瘤作用［6］,此協(xié)同作用并不是各自作用的簡單合并,而是起到了效應的放大.

研究表明［7］,抗VEGFmAb的抑瘤作用是暫時的,停止抗體后腫瘤又會恢復原來的生長活性.因而抗VEGFmAb須與具有細胞毒作用的治療措施聯(lián)合才能起到協(xié)同作用［8］.抗VEGFmAb放射增敏的機制可能比較復雜,Winkler等［9］發(fā)現,抗VEGFmAb能誘導腫瘤血管出現一個“血管正常化的窗口期”,在此期間內,腫瘤血管與正常血管功能相似,腫瘤氧水平高,提高了腫瘤細胞對放射的敏感性,因此在窗口期內給予放射才能起到協(xié)同抗腫瘤作用.“血管正?；翱谄凇背霈F在抗體治療的1wk左右,我們也選擇這一時期給予放射治療,收到了預期的結果.

血管形成是一個復雜的過程,有多種生長因子參與其中;放射治療又涉及時間劑量分割方式的不同,我們的實驗結果只是其中可行性組合之一.放射與抗VEGFmAb聯(lián)合治療肝癌取得了較好的實驗效果,是肝癌綜合治療方法的一條新思路.

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