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【關(guān)鍵詞】體外循環(huán)

【摘要】目的探索體外循環(huán)前后膜結(jié)合彈性蛋白酶（MBE）動力學(xué)變化，及MBE與術(shù)后炎性反應(yīng)及組織功能之間可能存在的聯(lián)系。方法連續(xù)收集10例體外循環(huán)下冠狀動脈搭橋手術(shù)病人的資料，血樣采集時間為開胸前、主動脈開放后、體外循環(huán)結(jié)束時、停機(jī)后3h和6h、術(shù)后第一天。分離血樣中的中性粒細(xì)胞，使用底物分析法測定被分離的中性粒細(xì)胞的MBE。通過常規(guī)實驗方法測定炎性反應(yīng)和組織功能的生化標(biāo)記物。結(jié)果開放主動脈后，MBE輕度升高，停機(jī)時達(dá)峰值，在術(shù)后第一天恢復(fù)到術(shù)前水平。與主動脈開放后中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)滯留相比，左房與右房血中的MBE沒有差異。MBE或MBE總活性與術(shù)后炎性反應(yīng)標(biāo)記物如C反應(yīng)蛋白（CRP）及組織功能標(biāo)記物如乳酸、肌酸磷酸激酶（CPK）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶之間均無相關(guān)關(guān)系。結(jié)論體外循環(huán)促使中性粒細(xì)胞MBE表達(dá)，并在停機(jī)時達(dá)高峰，但與體外循環(huán)后炎性反應(yīng)和組織功能的生化標(biāo)記物之間沒有特定關(guān)聯(lián)，提示體外循環(huán)中還有其他重要機(jī)制參與了術(shù)后炎性反應(yīng)和器官功能障礙的發(fā)生。

【關(guān)鍵詞】體外循環(huán)；中性粒細(xì)胞膜結(jié)合彈性蛋白酶

EffectofCPBonmembrane-boundelastaseofneutrophils

【Abstract】ObjectiveTostudytheeffectofcardiopulmonarybypass(CPB）onthekineticchangeofmembrane-boundelastase(MBE）anditspossiblelinktothepostoperativeinflammationandorganfunction.MethodsTenconsecutivepatientsundergoneelectivecoronarybypasssurgerywithCPBwererecruitedinthestudy.Bloodsamplesweretakenbeforemediansternotomy,afteraorticdeclmping,attheendofCPB,3hand6hafterCPBandonthefirstpostoperativedayrespectively.MBEwasdeterminedbysubstrateassayfromisolatedneutrophils.Inflammationandorganfunctionmarkersweredeterminedwithroutinelaboratorymethods.ResultsMBEslightlyincreasedafteraorticdeclamping,reachedtoitspeakattheendofCPB,andreturnedtoitspreoperativelevelonthefirstpostoperativeday.Incontrasttolungsequestrationofneutrophilcount,therewerenotranspulmonarygradientofMBEbetweenleftandrightatriumafteraorticdeclamping.NeitherMBEnortotalMBEactivitywaspositivelycorrelatedwiththepostoperativeinflammationmarkerssuchasbloodlactateandC-reactiveproteinandorganfunctionmarkerssuchascreatinephosphokinaseandalanineaminotransferase.ConclusionCPBinducesMBEexpressiononneutrophilswithitspeakattheendofCPB.LackofassociationbetweenneutrophilMBEandclinicalmarkerssuggeststhatmultiplesystemsareinvolvedinthepost-CPBinflammatoryresponseandorgandysfunction.

【Keywords】cardiopulmonarybypass;membrane-boundelastaseofneutrophils

體外循環(huán)（CPB）能通過激活循環(huán)中細(xì)胞與體液成分，引起全身炎性反應(yīng)綜合征［1，2］。激活的中性粒細(xì)胞釋放出的彈性蛋白酶，被認(rèn)為是能夠降解各種蛋白如彈性蛋白、纖維蛋白、糖蛋白等強(qiáng)有力的蛋白水解酶之一［3］。心內(nèi)直視手術(shù)的病人在轉(zhuǎn)流中和轉(zhuǎn)流后，中性粒細(xì)胞均能釋放彈性蛋白酶［4～7］，但游離彈性蛋白酶能被體內(nèi)廣泛存在的蛋白水解酶抑制劑(proteaseinhibitor,PI）迅速結(jié)合而失去活性［8］。最近發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞膜結(jié)合彈性蛋白酶(membraneboundelastase,MBE）能抵抗血漿和組織中蛋白水解酶抑制因子的作用［9］，而且結(jié)合于中性粒細(xì)胞膜上的彈性蛋白酶，在攻擊血管內(nèi)皮細(xì)胞和引起組織損傷方面，較血漿中游離的彈性蛋白酶具有更強(qiáng)的生物活性［10～12］。本研究的目的就是研究心臟手術(shù)病人在轉(zhuǎn)流中和轉(zhuǎn)流后MBE的動力學(xué)變化，并試圖尋找其與術(shù)后炎性反應(yīng)及組織功能變化之間的關(guān)系。

1資料與方法

1.1一般資料2004年11月1日～2004年11月30日，連續(xù)10例行擇期冠脈搭橋術(shù)患者。術(shù)前排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）存在感染；（2）全血白細(xì)胞總數(shù)>10000/μl；（3）中性粒細(xì)胞計數(shù)>7000/μl；（4）紅細(xì)胞沉降率>20mm/h；（5）C反應(yīng)蛋白（CRP）>8mg/L。病人的一般資料見表1。

1.2血樣采集和臨床數(shù)據(jù)收集于開胸前5min（T0）、體外循環(huán)結(jié)束時（T3）以及術(shù)后第一天8Am（T4）分別抽取橈動脈血15ml,并在主動脈開放后10min從左房（T1）和右房（T2）各抽血15ml。10ml全血用0.2%Na2EDTA溶液0.5ml抗凝后測定MBE，余5ml送檢中性粒細(xì)胞計數(shù)、血淀粉酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、肌酸磷酸激酶（CPK）和CRP。

表1一般資料（略）

臨床血流動力學(xué)和呼吸參數(shù)分別于術(shù)前5min、停機(jī)時、停機(jī)后3h和6h以及術(shù)后第一天8Am收集。血流動力學(xué)參數(shù)包括心率(HR）、平均動脈血壓(MAP）、左房壓（LAP）和中心靜脈壓（CVP）；呼吸功能參數(shù)包括肺順應(yīng)性（lungcompliance,LC）和彈性氣道阻力(airwayresistance,AR）。

1.3MBE測定

1.3.1中性粒細(xì)胞分離10ml全血在4℃下以1500rpm離心10min，收集上層血漿置于-20℃保存。細(xì)胞成分用PBS液(phosphatebuffersolution,PBS）按1∶1比例稀釋后待用。將4ml密度為1.1026g/ml的74%Percoll-0.9%NaCl溶液注入一個14ml的聚苯乙烯試管，在其上層小心覆蓋4ml密度為1.0776g/ml的55%Percoll-0.9%NaCl溶液，將4ml稀釋后的血樣覆蓋在最上層。于4℃下以350×g離心20min后，中性粒細(xì)胞聚集于兩層不同濃度的Percoll溶液之間。用吸管收集中性粒細(xì)胞，加入4℃PBS液洗滌2次，以350×g離心15min后，加入低滲溶液（0.83%NH4Cl，0.0037%Na2EDTA,0.1%KHCO3）,在室溫下孵育5min，溶解殘留的紅細(xì)胞。以160×g離心5min，用PBS洗滌后收集中性粒細(xì)胞并計數(shù)。經(jīng)Giemsa染色后檢查中性粒細(xì)胞的純度，發(fā)現(xiàn)純度＞95%，經(jīng)苔盼藍(lán)（0.01%濃度）排除法檢查細(xì)胞活力，證明活度＞95%［13］。

1.3.2中性粒細(xì)胞膜結(jié)合彈性蛋白酶的檢測將分離、收集的中性粒細(xì)胞與含有3%（W/V）聚甲醛和1%戊二醛的PBS液在4℃下混合3min，以PBS液洗滌2次，再次計數(shù)并用PBS液稀釋至中性粒細(xì)胞濃度為2×106/ml，已證明此固定法對MBE的活性沒有影響［9］。MBE活性通過底物分析法測定：取50μl中性粒細(xì)胞稀釋液，加入150μl多肽底物溶液［(1mMN-succinyl-(L-alanine）3-p-nitroanilide,200mMTris-HCl,pH=8.0,Sigma,St.Louis,USA）］，37℃下孵育60min后加入5μl冰醋酸結(jié)束反應(yīng)。在405nm下比色，通過不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)彈性蛋白酶溶液(Sigma,St.Louis,USA）與底物反應(yīng)的關(guān)系曲線得出MBE活性,此分析法的敏感度可達(dá)0.5ng/106中性粒細(xì)胞。使用下列公式將測得值轉(zhuǎn)換成中性粒細(xì)胞MBE總活性。

MBE總活性(ng/ml）=MBE（ng/106）×中性粒細(xì)胞數(shù)量（106/ml）

1.4統(tǒng)計學(xué)方法使用成對t檢驗法檢驗各時刻間實驗室和臨床數(shù)據(jù)有無差異，使用Pearson相關(guān)分析檢驗臨床與實驗室指標(biāo)間關(guān)系，數(shù)據(jù)用平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05示統(tǒng)計學(xué)差異顯著。

2結(jié)果

10例患者轉(zhuǎn)流時間平均(124±35）min,主動脈阻斷時間平均(86±27）min。術(shù)后多巴胺最大劑量為(11.8±7.4）μg/kg，腎上腺素最大劑量平均(0.02±0.03）μg/kg，術(shù)后第一天8Am前外科引流量平均為(612±300）ml，尿量平均為(116±40）ml/h,病人均康復(fù)出院，平均住院(14.3±5.6）天，無明顯的感染、圍手術(shù)期心梗或外科出血。

2.1中性粒細(xì)胞計數(shù)術(shù)前中性粒細(xì)胞計數(shù)為(3720±1039）×106/L，主動脈開放后10min，右房中性粒細(xì)胞計數(shù)上升至(4950±1964）×106/L（P＜0.05）。右房與左房中性粒細(xì)胞計數(shù)差異有顯著性，分別為(4950±1964）×106/L及(3600±1761）×106/L（P＜0.05）。體外循環(huán)結(jié)束以及術(shù)后第一天，中性粒細(xì)胞計數(shù)分別為(9920±4081）×106/L（P＜0.01）及(15340±3139）×106/L（P＜0.01）。

2.2MBE活性和MBE總活性（表2）術(shù)前MBE活性為(123.7±62.4）ng/106中性粒細(xì)胞。主動脈開放后10min，右房和左房內(nèi)MBE分別增加至(161±120）ng/106及(160.9±88.7）ng/106，但與術(shù)前相比統(tǒng)計學(xué)無顯著差異。體外循環(huán)結(jié)束時，MBE較術(shù)前明顯增高，達(dá)(205.7±88.0）ng/106（P＜0.01），術(shù)后第一天MBE值低于術(shù)前水平［（109.6±102.9）ng/106］，但與術(shù)前差異無顯著性。MBE總活性受中性粒細(xì)胞數(shù)量影響較大，主動脈開放后右房與左房內(nèi)MBE總活性分別為（854±700）ng/ml和（658.3±574.9）ng/ml，與術(shù)前相比無明顯差異，心房間差別也不顯著（P=0.318）。體外循環(huán)結(jié)束時MBE總活性較術(shù)前明顯升高，分別為（2129.5±1360.4）ng/ml及（448.0±193.2）ng/ml（P＜0.05）。術(shù)后第一天，MBE總活性比術(shù)前明顯升高，達(dá)（1755.0±1739.0）ng/ml（P＜0.05）。

表2MBE及MBE總活性變化（略）

注：與術(shù)前比較采用成對t檢驗*P＜0.05，**P＜0.01

2.3組織功能、生化指標(biāo)、血流動力學(xué)及呼吸動力學(xué)變化見表3。術(shù)后第一天，CPK、血淀粉酶較術(shù)前顯著升高（P＜0.05），術(shù)后第一天CRP較術(shù)前差異有非常顯著性［（3.25±4.05）mg/L及（77.47±29.83）mg/L］，(P＜0.01）。術(shù)后第一天血糖水平較體外循環(huán)結(jié)束時及術(shù)后3h均明顯增加（P＜0.05）。血乳酸水平于體外循環(huán)后及術(shù)后第一天較術(shù)前明顯增加（P＜0.01）。

表3血流動力學(xué)、血液生化檢查（略）

注：ND:未檢測；與術(shù)前比較采用成對t檢驗*P＜0.05，**P＜0.01

平均動脈壓和左房壓在體外循環(huán)前后差異無顯著性。體外循環(huán)結(jié)束后6h的氣道阻力明顯低于停機(jī)后3h。肺順應(yīng)性在停機(jī)后3h和6h沒有明顯差別。使用Pearson相關(guān)分析，各時刻MBE總活性和MBE呈正相關(guān)(P＜0.05）,未見MBE或MBE總活性與組織功能、生化指標(biāo)、臨床血流動力學(xué)或呼吸功能參數(shù)之間有相關(guān)關(guān)系。

3討論

在體外循環(huán)中或結(jié)束后所釋放的炎性介質(zhì)中，被激活的中性粒細(xì)胞所釋放的彈性蛋白酶能作用于不同的蛋白底物，它是最強(qiáng)的蛋白水解酶之一。這種酶儲存于中性粒細(xì)胞的胞漿顆粒中，體外循環(huán)中許多因素諸如肝素抗凝、溫度改變、缺血再灌注等都可以激活中性粒細(xì)胞，并促使其釋放彈性蛋白酶和氧自由基等毒性物質(zhì)對組織造成損傷［14～16］。但體內(nèi)存在大量血漿型或組織型蛋白水解酶抑制劑(PI），中性粒細(xì)胞釋放到血液或組織中游離的彈性蛋白酶與之結(jié)合后，其降解蛋白的作用將被抑制。體外循環(huán)中血漿彈性蛋白酶與蛋白酶抑制劑復(fù)合物在體外循環(huán)后數(shù)小時內(nèi)達(dá)到高峰，并在術(shù)后1周仍保持較高水平［17］。膜結(jié)合彈性蛋白酶失去蛋白酶抑制劑結(jié)合位點，因此它的活性不受抑制劑的影響，從而能發(fā)揮其降解作用［9］。多種細(xì)胞因子、內(nèi)毒素等能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞表達(dá)膜結(jié)合彈性蛋白酶［9～11］。當(dāng)激活的白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附時，MBE從中性粒細(xì)胞膜上不同部位向中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合處轉(zhuǎn)移，繼而水解內(nèi)皮細(xì)胞間的連接蛋白，有助于中性粒細(xì)胞完成向血管外的“游走過程”,這一機(jī)制已被體外趨化實驗?zāi)Ｐ退C實［10，12］。因此，MBE在中性粒細(xì)胞的出血管過程和組織消化過程中起重要作用，但其在體外循環(huán)前后的動力學(xué)變化及作用機(jī)制仍不為人們所知。

本研究中，我們觀察到從體外循環(huán)開始至升主動脈開放前，MBE保持在較低水平，體外循環(huán)結(jié)束時，MBE快速達(dá)到高峰，在術(shù)后第一天，又回到術(shù)前水平。與血漿中彈性蛋白酶-PI復(fù)合物的動力學(xué)相比，MBE變化時間短，上升和下降的速率快，這一特點使之能更敏感地反映體外循環(huán)對中性粒細(xì)胞的影響。體外循環(huán)后，大量白細(xì)胞從骨髓和邊緣池進(jìn)入血循環(huán)，但MBE在術(shù)后第一天即回至術(shù)前水平，說明新釋放的白細(xì)胞沒有MBE異常表達(dá)(圖1，表4）。

圖1體外循環(huán)前后體循環(huán)中性粒細(xì)胞數(shù)量和MBE活性的動態(tài)變化（略）

T0：手術(shù)前；T1：主動脈開放后10min；T2：體外循環(huán)結(jié)束；T3：手術(shù)后第一天。使用配對t檢驗與T0時刻比較*P<0.05，**P<0.01

表4體外循環(huán)前后體循環(huán)中性粒細(xì)胞數(shù)量和MBE活性的動態(tài)變化（略）

肺對白細(xì)胞的扣押是體外循環(huán)激活白細(xì)胞后的現(xiàn)象［18］。文獻(xiàn)顯示，開放主動脈后，左房內(nèi)氧自由基濃度較右房高，提示肺血管參與了中性粒細(xì)胞的激活［18］。本研究中，我們曾假設(shè)左房內(nèi)MBE活性比右房高，然而，結(jié)果顯示在左房和右房內(nèi)的MBE活性沒有差別，這提示肺在誘導(dǎo)MBE表達(dá)方面作用甚微（圖2，表5）。

圖2主動脈鉗開放后10min左房和右房中性粒細(xì)胞數(shù)量和MBE活性（略）

RA:右房;LA:左房。右房和左房差異使用配對t檢驗，*P<0.05

表5主動脈鉗開放后10mins左房和右房中性粒細(xì)胞數(shù)量和MBE活性（略）

與MBE相比，MBE總活性真正反映了體內(nèi)MBE總量。基于上述MBE在中性粒細(xì)胞的出血管過程和組織消化過程中所起的重要作用，MBE總活性的改變應(yīng)與組織損傷生化標(biāo)記物、器官功能參數(shù)變化相一致，MBE總活性減少應(yīng)伴隨諸如C反應(yīng)蛋白、肌酸磷酸激酶、血淀粉酶等生化標(biāo)記物的減少及心、肺功能參數(shù)趨向好轉(zhuǎn)，但在本研究中未發(fā)現(xiàn)這種緊密相關(guān)關(guān)系。這提示在體外循環(huán)導(dǎo)致的炎性反應(yīng)和組織損傷中，除膜彈性蛋白酶外，尚有其他重要機(jī)制參與了這一過程。

4結(jié)論

體外循環(huán)可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞膜上的MBE表達(dá)增加，MBE變化時間短，上升和下降的速率快，能更敏感反映體外循環(huán)對中性粒細(xì)胞的影響。經(jīng)過肺循環(huán)的中性粒細(xì)胞，其膜上MBE的表達(dá)沒有改變，提示肺在誘導(dǎo)MBE表達(dá)方面作用甚微。MBE在中性粒細(xì)胞的出血管過程和組織消化過程中起著重要作用，但MBE和MBE總活性與CRP等無明顯相關(guān)，提示在體外循環(huán)導(dǎo)致的炎性反應(yīng)和組織損傷中，除膜彈性蛋白酶外，尚有其他重要機(jī)制參與了這一過程。

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