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一、試劑

單抗（抗vWFA3區(qū)）及SZ－34（抗vWFA2區(qū)）為本研究所研制；正常健康人全血由蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院和本研究所志愿者提供；Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原為Sigma公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗人vWF抗體為；四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色液為美國Thermo公司產(chǎn)品；乙酸為國產(chǎn)分析純試劑。主要緩沖液：TBS緩沖液：；洗滌緩沖液：；包被緩沖液：碳酸鹽緩沖液；封閉緩沖液：1％牛血清白蛋白（BSA）－TBS；樣品稀釋緩沖液：同封閉緩沖液；終止液：硫酸；均由本實(shí)驗(yàn)室制備。

二、方法

1．vWF膠原結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)乙酸酸化的人胎盤Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原濃度均為20μg／ml，以100μl／孔包被在96孔板上4℃過夜，經(jīng)洗滌后，每孔用含10g／LBSA的TBS以200μl／孔封閉過夜。經(jīng)TBS－0．1％Tween再次洗滌后，每孔分別加入正常人混合血漿50μl和SZ－12350μl共計100μl／孔，單抗SZ－123濃度依次倍比稀釋，空白對照孔為100μl1％BSA－TBS。37℃孵育2h，用洗滌緩沖液洗滌3次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗人vWF抗體于37℃孵育2h，洗滌3次，用TMB顯色10min，硫酸3mol／ml終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450nm檢測。單抗SZ－34作陰性對照，方法同上。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。2．平板流動小室內(nèi)血小板黏附實(shí)驗(yàn)用75％酒精消毒載玻片，自然晾干，將100μg／ml乙酸酸化的Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原分別包被在載玻片上，4℃過夜，經(jīng)0．9％生理鹽水洗滌后用2％BSA－PBS封閉過夜，經(jīng)0．9％生理鹽水洗滌后，備用。應(yīng)用剪切力為1000s－1的FlowChamber實(shí)驗(yàn)，整個灌注過程均在37℃小室中進(jìn)行，經(jīng)肝素（40U／ml）抗凝的人全血2管，1管加單抗SZ－123，另1管為SZ－34陰性對照，均在37℃孵育10min，然后全血在包被有膠原的載玻片表面小室中灌注，將經(jīng)血小板黏附的載玻片表面用生理鹽水灌注2次后，在倒置顯微鏡下觀察血小板的黏附情況。

三、平板流動小室內(nèi)血小板黏附實(shí)驗(yàn)

在高條件下，SZ－123抑制人血小板在Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原上的；Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原表面血小板黏附率分別為90％、95％、60％，加有單抗SZ－123的全血血小板表面黏附率分別為11％、4％、28％。一討論血栓形成過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷時內(nèi)皮下膠原等細(xì)胞外基質(zhì)暴露，與循環(huán)血液中vWF結(jié)合，使vWF構(gòu)型發(fā)生改變，或者在高剪切力條件下vWF構(gòu)型發(fā)生改變，暴露了血小板膜糖蛋白GPⅠb的結(jié)合位點(diǎn)，vWF在血小板和血管壁之間形成橋梁介導(dǎo)血小板黏附到受損的血管壁或病變的血管部位，使血小板黏附、聚集和活化，引起活化血小板釋放進(jìn)一步放大，最終引起血液的凝固和血栓的形成。膠原是激活血小板的重要物質(zhì)，能誘導(dǎo)血小板呈不可逆聚集。在內(nèi)皮損傷后，膠原首先激活血小板，從而啟動凝血鏈鎖反應(yīng)產(chǎn)生凝血酶，血小板繼續(xù)被活化，并不斷釋放出ADP和血栓素A2，導(dǎo)致血小板在局部不斷地被激活。膠原與血小板之間的相互作用是保證血小板發(fā)生牢固黏附和聚集反應(yīng)、并形成血小板血栓的關(guān)鍵步驟。vWF主要通過A1和A3區(qū)與血小板GPⅠb和膠原結(jié)合，A1區(qū)主要參與GPⅠb和Ⅳ型膠原的結(jié)合，A3區(qū)則主要參與Ⅰ、Ⅲ型膠原的結(jié)合，在不同情況下（如不同流體動力學(xué)或不同細(xì)胞外基質(zhì)），A1和A3區(qū)將發(fā)揮不同程度的作用。我們之前報道了1株特異性針對vWFA3區(qū)的單抗SZ－123，該單抗不僅能抑制vWF與Ⅲ型膠原的結(jié)合，還能抑制vWF與血小板的結(jié)合，這一結(jié)果提示vWFA3區(qū)膠原結(jié)合部位可能動態(tài)調(diào)節(jié)vWFA1區(qū)的功能。本研究的各型膠原結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證了這種猜測，SZ－123對A3區(qū)結(jié)合的Ⅰ、Ⅲ型膠原抑制率達(dá)到95％和96％，而對A1區(qū)結(jié)合的Ⅳ型膠原也有一定的抑制功能，且說明了單抗SZ－123對血管內(nèi)皮下各型膠原均有抑制作用，驗(yàn)證了單抗SZ－123的抗血栓作用。血管損傷后，血管剪切力誘導(dǎo)vWF發(fā)生自發(fā)性聚集，并募集血液循環(huán)中的血小板，使血小板黏附于受損內(nèi)皮下的膠原纖維中，從而啟動血栓形成FlowChamber模擬了體內(nèi)血管剪切力、溫度等環(huán)境，通過這種方式來檢驗(yàn)單抗SZ－123的抗血栓作用，證實(shí)SZ－123具有很好的抗血小板聚集功能。綜上所述，本研究通過體外的膠原結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)及模擬體內(nèi)血管環(huán)境的FlowChamber實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了SZ－123作為新一代抗血小板藥物的效能，為SZ－123成為新一代的抗血小板藥物臨床使用提供更充分的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

作者：姚拾秀江淼趙益明單位：蘇州大學(xué)