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1材料與方法

材料金銀花新鮮花蕾于2011年4～5月采自山東臨沂,憑證標(biāo)本保存于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所。經(jīng)李圣波鑒定后樣品保存于80℃冰箱中,備用。

2基因克隆

依據(jù)金銀花LJPAL1(JX068601)基因編碼區(qū)序列,利用軟件Primer-Premier5設(shè)計引物:;利用金銀花反轉(zhuǎn)錄一鏈cDNA作為模板進行PCR反應(yīng),用于全長cDNA的擴增。PCR反應(yīng)體系為:,模板1μL,引物應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5min,然后進行30個循環(huán),循環(huán)結(jié)束后72℃10min,4℃保溫。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,利用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒(上海生工生物有限公司)回收目標(biāo)PCR產(chǎn)物,并將其與pMD19-T載體連接,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上進行藍白斑篩選,選擇陽性克隆送北京六合華大基因公司測序。將鑒定正確的質(zhì)粒命名為pMD19-PAL1,并利用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒(上海生工生物有限公司)提取質(zhì)粒。

3原核表達載體構(gòu)建

分別將pMD19-PAL1、pET-32a(+)載體質(zhì)粒用SalⅠ37℃酶切2h后,NotⅠ繼續(xù)酶切2h,用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物,利用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工生物有限公司)分別回收2.1kb、5.9kb左右的目的條帶。將兩片段在T4Ligase連接體系中,于16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,并利用PCR進行陽性克隆鑒定,引物序列、PCR體系和程序同上。挑選陽性克隆送北京六合華大基因公司測序。所構(gòu)建的原核表達載體,包含完整的LJPAL1的基因編碼區(qū),重組質(zhì)粒命名為pET32-PAL1。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa公司),并利用PCR進行陽性克隆鑒定,引物序列、PCR體系和程序同上。挑選陽性克隆北京六合華大基因公司測序。

4抗體制備

首先使用的是Geneious軟件進行二級結(jié)構(gòu)和親疏水性的預(yù)測,著重選擇有β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則蜷曲、親水的肽段;再使用SWISS-MODEL/)預(yù)測三級結(jié)構(gòu),著重選擇暴露在蛋白表面的肽段;根據(jù)以上信息綜合分析選擇最佳肽段作為候選抗原位點,并合成多肽抗原,制備多克隆抗體。取200μg免疫原,用生理鹽水稀釋到200～500μL,再加入等體積弗氏佐劑,初次免疫用弗氏完全佐劑,加強免疫用弗氏不完全佐劑;用混勻儀器將溶液和佐劑混勻,形成油包水。將混勻好的免疫原在2.0kg左右的新西蘭大白兔背部皮下注射免疫,打8～10個點。每隔12天加強免疫一次,每次免疫量為200μg蛋白。第3次免疫后10～15天采血,采用Protein-G親和純化相應(yīng)的多抗血清,獲得誘導(dǎo)6h后的大腸桿菌細(xì)胞總蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后,于20V恒壓下轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,時間約為40min。用5%脫脂奶粉封閉1h后按1∶2000稀釋比例加入一抗(LJPAL1多克隆抗體),60r·min1振蕩反應(yīng)1h,經(jīng)PBST洗滌后按1∶8000稀釋比例加入二抗(羊抗兔IgG,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),60r·min1振蕩反應(yīng)1h。用化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒顯色,采用UVP化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)觀察顯色結(jié)果。7酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)利用間接ELISA方法進行LJPAL1蛋白含量分析。取含有pET32-PAL1質(zhì)粒的大腸桿菌誘導(dǎo)表達,菌液超聲破碎后分別利用PBS緩沖液,溶于1L蒸餾水中,pH7.稀釋倍作為抗原,以PBS作為對照。包被PBS稀釋菌液,一抗為稀釋1000倍的金銀花PAL1多克隆抗體,二抗為羊抗兔IgG(1∶1000),最后以鄰苯二胺底物顯色,硫酸終止反應(yīng),用酶聯(lián)免疫分光光度計檢測490nm處的OD值。

作者：馮潔單位：北京科技大學(xué)