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1材料與方法

毒桿菌分離菌株FZ2007－1和FZ2007－2、DH5α均為福建省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所分離鑒定并保存。工具酶與主要試劑聚合酶、膠回收試劑盒均購自TaKaRa公司；細菌DNA提取試劑盒、普通肉湯培養(yǎng)基和普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基均從BDDifco公司購買；脫纖綿羊血購自鄭州益康生物工程有限公司。豬丹毒桿菌保護性抗原SpaA基因PCR引物合成參考副豬丹毒桿菌C43065株的SpaA基因序列設計了1對可以擴增SpaA全長基因的特異性引物，上游引物，下游引物S，預期擴增片段為1881bp，引物由TaKaRa公司合成。豬丹毒桿菌DNA的提取復蘇甘油凍存的細菌，即用接種針蘸取凍存的細菌，劃線接種于含5％脫纖綿羊血的普通肉湯瓊脂平板中，37℃倒置培養(yǎng)過夜；挑取單個菌落接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)過夜；離心沉淀后加入PBS重懸，應用DNA提取試劑盒按照說明書提取細菌DNA，－20℃保存?zhèn)溆?。豬丹毒桿菌SpaA基因的PCR擴增、克隆和測序以提取的基因組DNA為模板進行PCR反應。PCR反應條件：95℃預變性5min；94℃變性，72℃延伸1．5min，35個循環(huán)；72℃再次延伸10min。電泳后切膠用膠回收試劑盒回收DNA片段并與pMD18－T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細菌，涂布于含有氨芐青霉素抗性的LB瓊脂平板上，挑取細菌進行擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，通過PCR鑒定，選取陽性質(zhì)粒送TaKaRa公司測序。豬丹毒桿菌SpaA基因的同源性比對分析應用DNAman生物軟件，對所測2株豬丹毒桿菌SpaA基因序列與GenBank中登錄的部分豬丹毒桿菌菌株的SpaA基因進行同源性比較，并進行發(fā)育進化樹分析。豬丹毒桿菌保護性抗原SpaA的理化性質(zhì)及功能域分析選取1株豬丹毒桿菌分離株為研究對象，應用ExPASy工具對豬丹毒桿菌保護性抗原SpaA的性質(zhì)進行分析；應用ProtParam分析酶的氨基酸序列組成、相對分子質(zhì)量、等電點等理化性質(zhì)；分析酶的功能域進行蛋白信號肽預測。豬丹毒桿菌SpaA基因二級結(jié)構(gòu)預測應用EXPASY服務器上的SOPMA方案分析預測豬丹毒桿菌SpaA蛋白的二級結(jié)構(gòu)。豬丹毒桿菌保護性抗原SpaA蛋白的B細胞表位預測采用Hopp－Woods親水性參數(shù)、Zim－merman極性參數(shù)、柔韌性參數(shù)、抗原性參數(shù)和Emini表面可及性參數(shù)分別進行單參數(shù)預測。對各個參數(shù)的預測結(jié)果進行比較，最后進行綜合分析以確定豬丹毒桿菌SpaA蛋白的B細胞表位。

2結(jié)果

電泳條帶經(jīng)回收、克隆，以克隆后提取的質(zhì)粒為模板進行PCR陽性鑒定正確。豬丹毒桿菌SpaA基因的發(fā)育進化樹分析應用DNAman軟件對目的條帶的測序結(jié)果和Gen－Bank中部分豬丹毒桿菌菌株的SpaA基因進行發(fā)育進化樹分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本試驗分離的2株豬丹毒桿菌菌株與GenBank中其他菌株在進化樹中分布較遠，自成一個分支。豬丹毒桿菌SpaA蛋白的理化性質(zhì)分析選擇豬丹毒桿菌FZ2007－1分離株作為代表性毒株進行分析。用E分析豬丹毒桿菌的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，該酶有626個氨基酸，其相對分子質(zhì)量為72190．3，理論等電點（PI）為9．04，為偏堿性蛋白質(zhì)。豬丹毒桿菌SpaA蛋白的信號肽預測用分析SpaA蛋白的氨基酸序列信號肽的存在位置及序列，結(jié)果顯示，該酶氨基酸序列上信號肽的剪切位點位于第29～30個氨基酸。豬丹毒桿菌SpaA蛋白的功能域分析將豬丹毒桿菌SpaA蛋白的氨基酸序列提交到ScanPro－site服務器，對SpaA蛋白進行翻譯后修飾位點結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明，該蛋白有1個組蛋白賴氨酸N－甲基轉(zhuǎn)移酶家族元件，1個細胞壁結(jié)合重復元件，8個肉豆蔻酰化位點豬丹毒桿菌SpaA蛋白的二級結(jié)構(gòu)通過NPS＠服務器上的SOPMA方案預測SpaA蛋白的二級結(jié)構(gòu)成分，結(jié)果表明，該蛋白主要由α螺旋和無規(guī)則卷曲組成，其中，α螺旋有335個、占53．51％，延伸鏈有78個、占12．46％，β轉(zhuǎn)角有66個、占10．54％，無規(guī)則卷曲有147個、占23．48％。豬丹毒桿菌SpaA蛋白的B細胞表位預測分別對SpaA蛋白的極性、親水性、柔韌性、抗原性和表面可及性參數(shù)進行預測，B細胞抗原表位的數(shù)目及抗原表位可能出現(xiàn)的肽段有所不同，但均顯示，各種方案所預測的參數(shù)值均高于其他區(qū)段。因此，以上多個區(qū)段形成B細胞表位的可能性最大。

3討論

結(jié)果表明該片段能夠防止桿菌對豬的感染。Shimoj等也通過表桿菌SpaA蛋白N端2／3區(qū)域，免疫小鼠后，小鼠可產(chǎn)生較強的免疫保護力。對于蛋白的B細胞表位預測，已有多種單參數(shù)預測模型和相應的分析軟件，但為了克服單參數(shù)預測模型的局限性，提高預測的準確性，一般對多種參數(shù)的預測結(jié)果進行綜合考慮，其中比較重要的參數(shù)為親水性參數(shù)、極性參數(shù)和柔韌性參數(shù)。通常蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)的B細胞表位有較大的關(guān)系。豬丹毒是由豬丹毒桿菌引起的一種急性、熱性人畜共患傳染病，其主要特征表現(xiàn)為高熱、急性敗血癥、皮膚疹塊、慢性疣狀心內(nèi)膜炎及多發(fā)性非化膿性關(guān)節(jié)炎。該病分布廣泛、世界各地均有發(fā)生，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。特別是在最近2年，由于“高熱病”的暴發(fā)，導致豬群免疫力下降，豬丹毒在全國各地均有零星發(fā)生的報道，并有小范圍流行的可能性［19－20］。近幾年來，對豬丹毒桿菌的分子生物學和免疫學進行了一些研究，吾魯木汗·那孜爾別克等對豬丹毒桿菌SpaA基因的原核表達和重組疫苗的研究結(jié)果表明，SpaA蛋白具有良好的免疫保護作用。晏鵬飛等通過研究表明豬丹毒桿菌表面保護性蛋白A起主要保護功能的核心區(qū)段為氨基端，且是由抗體介導的免疫保護。Aimad等克隆和表達了編碼SpaA蛋白N端的基因片段，通過West－ernblot檢測其免疫功能，本試驗運用SOPMA方案預測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)合親水性方案、極性方案、柔韌性方案、Emini表面可及性方案和Jameson－Wolf抗原性指數(shù)方案多種方法綜合分析，發(fā)現(xiàn)該酶以α螺旋（占53．51％）、無規(guī)則卷曲（占23．48％）、延伸鏈（占12．46％）為主，而β轉(zhuǎn)角只占10．54％；并應用不同的方案預測了B細胞表位的優(yōu)勢區(qū)。本研究基于豬丹毒桿菌SpaA蛋白的氨基酸序列，通過對其二級結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)、親水性、表面可及性與抗原性等多種參數(shù)進行綜合分析，預測了SpaA蛋白可能的B細胞優(yōu)勢表位，為尋找特異性相關(guān)表位用于疫苗的設計、診斷試劑研發(fā)、免疫機理的探討等提供了理論依據(jù)，同時也為豬丹毒桿菌SpaA蛋白功能研究提供了線索。

作者：林琳江斌吳勝會張世忠單位：福建省農(nóng)業(yè)科學院