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本文作者：王啟業(yè)王義強凡利作者單位：中南林業(yè)科技大學(xué)生物技術(shù)實驗室

南方紅豆杉細胞培養(yǎng)及次生代謝研究

紅豆杉資源非常有限且紫杉醇含量極低，遠遠無法滿足市場的需求。植物細胞培養(yǎng)具有繁殖速度快，培養(yǎng)條件易于優(yōu)化，培養(yǎng)過程易于人工控制，不受時間、地域等因素的限制等優(yōu)點。因此，采用紅豆杉細胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇以及對紫杉醇合成代謝途徑進行調(diào)控來提高紫杉醇的產(chǎn)量已成為當今國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點課題之一，并已取得了較大進展。對其細胞培養(yǎng)、紫杉醇合成與代謝調(diào)控、擴大培養(yǎng)及分離純化[16-19]等方面開展了廣泛深入的研究，研究發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)調(diào)控[20-23]、物理控制[24-26]、前體飼喂[27]、添加抑制劑[28]、誘導(dǎo)子調(diào)控[20-21,29-33]、雙液相培養(yǎng)[34]、兩步法培養(yǎng)[35]等一系列技術(shù)均能影響南方紅豆杉的次生代謝。細胞離體培養(yǎng)縮短了培養(yǎng)周期，這樣不僅有利于培養(yǎng)條件的優(yōu)化，也為通過多種誘導(dǎo)途徑來提高細胞中次生代謝產(chǎn)物的含量成為可能，南方紅豆杉組培體系的不斷完善為進一步研究次生代謝產(chǎn)物的合成與代謝奠定了良好基礎(chǔ)。細胞培養(yǎng)的最終目的是為了提高紫杉醇的產(chǎn)量，因此利用生物反應(yīng)器替代搖瓶進行紅豆杉細胞規(guī)模培養(yǎng)以及工業(yè)化生產(chǎn)就成為另一個研究熱點和重點。目前，喜馬拉雅紅豆杉[17]、中國紅豆杉[36-37]、歐洲紅豆杉[17]、曼地亞紅豆杉[38]和云南紅豆杉[39]等均實現(xiàn)了生物反應(yīng)器的大規(guī)模培養(yǎng)，部分并已投產(chǎn)[38]。但南方紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)尚未實現(xiàn)生物反應(yīng)器的大規(guī)模培養(yǎng)，還正處在研究階段。另外，近幾年來，國內(nèi)外利用微生物發(fā)酵來生產(chǎn)紫杉醇的研究報道也不少，但目前利用內(nèi)生真菌來產(chǎn)生紫杉醇的產(chǎn)量并不高，尚未能進行工業(yè)化。

南方紅豆杉分子標記研究

近年來，隨著分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展，植物在蛋白質(zhì)和DNA水平上的遺傳多樣性研究取得了突破性的進展，并在物種鑒定和瀕危物種保護中得到廣泛的應(yīng)用。20世紀90年代以來，分子標記技術(shù)被廣泛用于動、植物遺傳育種、基因診斷、居群遺傳學(xué)、生物系統(tǒng)學(xué)與進化研究上，如RAPD標記技術(shù)和ISSR分子標記技術(shù)，這2種分子標志均可揭示種間與種內(nèi)的遺傳多樣性及其進化的親緣關(guān)系（但后者比前者穩(wěn)定性和重復(fù)性要好），可進一步為開展植物分子輔助育種、遺傳轉(zhuǎn)化及其轉(zhuǎn)基因等方面的研究提供有價值的理論依據(jù)。2000年，王艇等[40]采用RAPD技術(shù)，在分子水平上對南方紅豆杉的系統(tǒng)發(fā)育進行了探討。2003年，張宏意等[41]通過隨機擴增多態(tài)性方法對廣東、湖南、江西3省的12個南方紅豆杉自然居群進行了基因組DNA多態(tài)性分析，分析表明南方紅豆杉居群間的遺傳距離與這些居群的地理分布相關(guān)，相同或相鄰產(chǎn)地的居群間的遺傳距離較小，不同產(chǎn)地個體間的遺傳距離較大。2005年，王貴榮等[42]通過對6個紅豆杉種進行RAPD遺傳多樣性分析和染色體鑒定，得出南方紅豆杉與中國紅豆杉的遺傳距離最小，西藏紅豆杉與曼地亞紅豆杉的親緣關(guān)系最遠，6個紅豆杉種染色體數(shù)均為2n=24，為進一步保護和利用中國的紅豆杉資源提供進化分子遺傳學(xué)方面的依據(jù)。2007年，李振宇[43]根據(jù)cpDNA基因間隔區(qū)對南方紅豆杉的種群遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)地理進行了研究，同年，黃麗潔[44]采用葉綠體SSR技術(shù)對南方紅豆杉的遺傳多樣性和遺傳距離進行了研究，并認為南方紅豆杉具有中等水平遺傳多樣性，不同地區(qū)間遺傳分化小，種群和地區(qū)間基因流較大。2008年，茹文明等[45]通過RAPD技術(shù)對南方紅豆杉8個自然種群的遺傳多樣性進行了分析，得出南方紅豆杉種群瀕危的主要原因不是其遺傳多樣性，而可能是由其本身生物學(xué)和生態(tài)學(xué)特性及其生存環(huán)境破壞所致的。為進一步探討南方紅豆杉瀕危原因和對該物種的保護、進化潛力及種質(zhì)資源利用等方面提供分子遺傳學(xué)數(shù)據(jù)。2009年，張蕊等[46]利用ISSR分子標記對來自10省區(qū)15個南方紅豆杉代表性種源進行了種源遺傳多樣性及地理變化、種源遺傳分化等方面的研究，得出了與上面相一致的結(jié)論。同年，張玲玲[47]通過RAPD和ISSR2種分子標記對福建省的南方紅豆杉遺傳多樣性進行了初步研究，并對其RAPD和ISSR2種指紋圖譜進行了比較分析。2010年，李乃偉等[48]采用ISSR標記技術(shù)對南方紅豆杉遷地保護小種群及其衍生自然種群小斑塊（小居群）的遺傳多樣性進行了分析。結(jié)果表明，南方紅豆杉遷地保護各自然小居群間的遺傳距離與其地理生境有關(guān)，而與其地理距離并無顯著的相關(guān)性。2011年，李乃偉等[49]又對南方紅豆杉野生種群、遷地保護栽培種群及遷地保護衍生種群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進行ISSR分析和比較，得出南方紅豆杉遷地保護衍生種群的遺傳多樣性與野生種群接近，這為南方紅豆杉的物種遷地保護提供了有力依據(jù)。

南方紅豆杉基因工程研究

隨著基因工程技術(shù)的不斷成熟，植物基因工程在育種和研究天然活性物質(zhì)生物合成的分子機制上起到了極大的促進作用，它能突破常規(guī)育種的局限性，加快變異速度，快速獲得植株新品種。組織培養(yǎng)體系的建立與優(yōu)化為南方紅豆杉轉(zhuǎn)基因的研究提供了基礎(chǔ)和前提。目前，紫杉醇生物合成過程中的部分關(guān)鍵酶基因已成功克隆并進行了相關(guān)功能研究。2007年，燕麗娜等[50]以南方紅豆杉的新鮮嫩葉中基因組DNA為模板，克隆測序得到紫杉烷7β-羥基化酶的全長基因，并對其進行了進化分析。2010年，肖穎等[51]以南方紅豆杉愈傷中提取總RNA，成功得到紫杉二烯合成酶cDNA的全長序列，為南方紅豆杉轉(zhuǎn)基因做好了前期準備工作。同年，黃仕杰等[52]成功克隆了紫杉醇下游合成途徑關(guān)鍵酶之一的紫杉烷13α-羥化酶基因，并對其進行了生物信息學(xué)分析，為利用代謝工程技術(shù)生產(chǎn)紫杉醇或其前體物質(zhì)提供了分子基礎(chǔ)。次年，程抒劼等[53]又成功克隆了能夠催化10-去乙酰巴卡亭Ⅲ10位的乙酰，從而生成紫杉醇生物合成途徑中的最后一個雙萜中間體-巴卡亭Ⅲ的10-去乙酰巴卡亭-10-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，這就為紫杉醇的進一步商業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。隨著紫杉醇合成相關(guān)基因的一個個成功克隆，通過DNA重組技術(shù)獲得產(chǎn)紫杉醇含量高的轉(zhuǎn)基因植株即將成為可能。