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本文作者：程襯襯淮穩(wěn)霞姚艷霞趙文霞作者單位：中國(guó)林科院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所

櫟樹猝死病菌Phytophthoraramorum是一種危害性極大的病原菌，隸屬于藻界Chromista，卵菌門Oomycota，卵菌綱Oomycetes，霜霉目Peronospora-les，霜霉科Peronosporaceae，疫霉屬Phytophthora。其寄主范圍十分廣泛，危害多種林木和花卉，造成櫟樹和石櫟等樹木死亡以及杜鵑、莢蒾等花卉枝葉枯萎。病菌最早于1993年在德國(guó)和荷蘭有枯萎癥狀的杜鵑花和莢蒾分離得到。1995年美國(guó)加利福尼亞州櫟樹大面積死亡，分離到的病原菌，經(jīng)生物學(xué)和核酸分析研究證明，這2種菌為同一種疫霉。由于疫霉多分離于土壤和水流中，很少在木本植物枝干上分離得到，2001年由歐洲學(xué)者將其定名為P．ramorumsp．nov．［1］，即“枝干上的疫霉”。該病菌因在美國(guó)引起櫟樹等樹木突然死亡(SuddenOakDeath，簡(jiǎn)稱SOD)而聞名，故常常稱為櫟樹猝死病菌。病害在美國(guó)櫟樹和石櫟樹上的暴發(fā)，致使加州中部沿海的幾個(gè)城市和郊區(qū)森林公園中的成千上萬株樹木短時(shí)間內(nèi)迅速枯死，引起了世界各國(guó)廣泛的關(guān)注和警惕［2］。

1病原菌生物學(xué)性狀

1．1病原菌交配型

Phytophthoraramorum為異宗配合型真菌，具有兩種交配型Al和A2，只有當(dāng)Al和A2交配型共同培養(yǎng)才能完成有性生殖［1，3］。以往交配型的測(cè)定是通過交配型已知的菌株與待測(cè)菌株雜交以觀察其性器官的形成。這種方法比較耗費(fèi)時(shí)間而且不是非常可靠，一方面有些菌株并不在培養(yǎng)基里交配，另一方面，只有少數(shù)菌株測(cè)定了交配型?；赑．ramorum交配型基因的分子診斷測(cè)定方法還沒有取得進(jìn)展，因?yàn)檫@些疫霉屬的基因很少被了解，并沒有被克隆或者測(cè)序［4］。但是，北美洲以及歐洲種群的線粒體基因型看起來能充分區(qū)分兩種交配型，因?yàn)樗械腅U1世系都是A1交配型(少部分例外)，而NA1和NA2世系均為A2交配型。BoutetXetal．通過致病性分析表明，EU1×EU1交配產(chǎn)生的單卵孢株之間具有較大的變異性，超過50%的后代對(duì)杜鵑花葉片的侵染能力要小于親本，然而EU1×NA1交配后代和它們的親本之間卻沒有明顯的差異［5］。Brasieretal．研究表明，兩種交配型具有相同的寄主范圍，同一種菌株對(duì)不同寄主的致病力似乎是相同的［6］。

1．2病原菌無性系

無性系是指單一基因型的所有無性繁殖個(gè)體［7］，無性系對(duì)于P．ramorum種群生物學(xué)十分重要。無性系描述需要進(jìn)行大量的基因標(biāo)記，主要包括交配型(A1或A2)標(biāo)記、同功酶基因型標(biāo)記和DNA指紋標(biāo)記。P．ramorum變異性較大，嚴(yán)重限制了種群基因型研究。利用交配型標(biāo)記、無性基因標(biāo)記和生物化學(xué)標(biāo)記為P．ramorum種群研究提供可靠且持續(xù)的依據(jù)。Elliotetal．利用PCR-RFLP標(biāo)記技術(shù)研究確定了P．ramorum種群由3種無性系組成:一種源自歐洲(EU1)，另外兩種源自美國(guó)(分別為NA1和NA2)［8］。最初的交配研究表明，所有的EU1世系都是A1交配型，而NA1和NA2世系均為A2交配型［1，9］。但自2003年以來，歐洲發(fā)現(xiàn)了A2型菌株［10］，美國(guó)也發(fā)現(xiàn)了A1型菌株［11－12］，這表明了不同交配型之間雜交的潛力。無性系之間的區(qū)別不僅表現(xiàn)在交配型上，在形態(tài)學(xué)［13］、侵染力［9］、保守基因的核苷酸序列［14］以及遺傳多樣性［15－16］方面都存在差異。但是這些世系是古已有之還是近代人為原因造成的并不清楚。為了解這3種世系的進(jìn)化歷史以及它們之間的關(guān)系，Gossetal．分析了一段具有5個(gè)細(xì)胞核突變位點(diǎn)的DNA序列，發(fā)現(xiàn)同一世系內(nèi)的菌株之間并沒有區(qū)別［17］。聯(lián)合多種研究方法分析表明，3種世系大約已經(jīng)進(jìn)化了有16.5萬～50萬年的歷史。基因中包含了3種世系歷史性重組的鮮明特征，表明P．ramorum的祖先是通過有性生殖完成繁衍的。3種世系的基因差異很大，表明它們并不是通過單一的雜交繁殖種群產(chǎn)生的。相反，3種世系更可能來自3種不同的地理位置，它們?cè)谶M(jìn)入北美洲和歐洲之前各自獨(dú)立進(jìn)化。

1．3病原菌培養(yǎng)

陰冷潮濕的環(huán)境對(duì)病原菌的生長(zhǎng)有利，特別是當(dāng)葉片及樹皮表面出現(xiàn)水膜時(shí)更有利于菌絲的生長(zhǎng)［18］。病原菌生長(zhǎng)的最適溫度為20℃，在15～25℃的條件下均能正常生長(zhǎng);－1℃時(shí)病菌生長(zhǎng)緩慢，－9℃時(shí)仍可存活;當(dāng)外界溫度超過30℃時(shí)，菌絲即停止生長(zhǎng):但是如果病原菌在陰冷的雨季侵入寄主，30℃的非持續(xù)氣溫下病害仍然發(fā)生［1，10，19］。

2傳播方式

P．ramorum可以產(chǎn)生厚垣孢子和游動(dòng)孢子。游動(dòng)孢子具鞭毛，可以自由游動(dòng)。孢子可借助風(fēng)力在空氣中近距離傳播，亦可借助雨水噴濺到易感植物上面，或者通過河流傳播到較遠(yuǎn)的地方;遠(yuǎn)距離傳播則主要是借助人類活動(dòng)和寄主植物調(diào)運(yùn)以及進(jìn)出口貿(mào)易［20］。

3分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)在P．ramorum研究中的應(yīng)用

作為形態(tài)學(xué)鑒定的輔助，分子生物學(xué)和免疫學(xué)方法檢測(cè)P．ramorum的技術(shù)亦層出不窮，主要包括基于核糖體ITS片段和線粒體基因片段的傳統(tǒng)PCR方法，PCR-SSCP技術(shù)，PCR-RFLP標(biāo)記技術(shù)，ELISA法，巢氏PCR法，以及微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)等等。

多數(shù)研究表明，以美國(guó)農(nóng)業(yè)部動(dòng)植物檢疫局推薦的巢式PCR技術(shù)和歐洲及地中海植物保護(hù)組織(EP-PO)推薦的熒光PCR技術(shù)最為成熟可靠。一般來說，ELISA法具有相對(duì)較高的通量，可以減少樣品的使用量。ELISA法可以用來篩選所有的疫霉屬，但僅僅能鑒定到屬，而不能達(dá)到鑒定到種的水平［21］，可以作為檢測(cè)的第一階段，以便PCR技術(shù)的進(jìn)一步施行。

Hayden等運(yùn)用SYBRGreenI核酸染料，以ITS片段為基礎(chǔ)，利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)出了P．ramorum［22］。Hughes等對(duì)這一方法改進(jìn)，發(fā)明了一種特殊的儀器(SmartCycler)，可以在野外使用［23］。

Bilodeau等以ITS、β微管蛋白和隱地蛋白等片段為基礎(chǔ)，利用TaqMan探針和SYBRGreenI核酸染料檢測(cè)出了P．ramorum［24］。但是較多研究表明，利用核糖體的ITS區(qū)域不能準(zhǔn)確區(qū)分P．ramorum與其相近的疫霉屬以及P．ramorum的3種世系［22，25－26］。由于線粒體基因Cox1在基因組里顯示出高拷貝數(shù)，與單拷貝基因相比，它提供了一個(gè)較大的目標(biāo)集中區(qū)，而且它在P．ramorum的3種世系間的片段是不同的［14－15，27］，所以被較多的運(yùn)用到分子生物學(xué)的研究中。ElliottM等利用基于Cox1基因的PCR-RFLP分子標(biāo)記技術(shù)確立北美和歐洲P．ramorum種群的3種世系，他們首先利用ApoI把P．ramorum從其他種群里分離出來，把EU1世系從北美洲種群里分離出來，然后利用AvaI區(qū)分NA1和NA2的基因型［8］。

伴隨著線粒體DNA序列的測(cè)序成功，利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)來檢測(cè)P．ramorum的技術(shù)發(fā)展越來越快。與傳統(tǒng)的PCR方法相比，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)具有更高的敏感性和更強(qiáng)的特異性。TooleyPW等利用線粒體基因片段結(jié)合此技術(shù)鑒別了P．ramorum和P．pseudosyringae(一種在意大利發(fā)現(xiàn)的新種)［18］。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)可以非常迅速地檢測(cè)來自野外的少量樣品，通過序列來區(qū)分菌株，因?yàn)橥瑯哟笮〉臉悠冯m然在序列上有輕微的差異，但它們的解鏈溫度并不一致［28－29］。更簡(jiǎn)單的方法例如PCR-RFLP技術(shù)和巢氏PCR技術(shù)可以在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行并且不需要很專業(yè)的設(shè)備。IvorsKL等利用RFLP技術(shù)表明在北美洲種群里，一個(gè)單一的無性系占據(jù)主導(dǎo)地位，而歐洲的種群則是由一列獨(dú)特而緊密聯(lián)系的RFLP類型組成的。同時(shí)，他們還分析了3條基因片段(ITS，coxII，nad5)的序列，結(jié)果表明所有的P．ramorum菌株的這3段序列都是相同的，系統(tǒng)發(fā)育分析表明P．ramorum與P．lateralis及P．hibernalis親緣關(guān)系最近［16］。IvorsKL等通過研究發(fā)現(xiàn)在加利福尼亞州苗圃里的病原菌基因多樣性比森林里的高一些［15－16］。

在P．ramorum世系中，高變量微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)被證明可以調(diào)查其種群結(jié)構(gòu)。微衛(wèi)星作為共顯性標(biāo)記最突出的特點(diǎn)是可以呈現(xiàn)出較高的變異性，從而被頻繁地應(yīng)用于種群基因結(jié)構(gòu)的研究中。但是對(duì)于無性繁殖的生物體來說，多變微衛(wèi)星位點(diǎn)的識(shí)別仍然鮮有研究。

IvorsK等［16］和ProsperoS等［30］分別設(shè)計(jì)了12對(duì)和10對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記，但只有少數(shù)在NA1世系中展現(xiàn)出極強(qiáng)的變異性。IvorsK等在美國(guó)森林的種群里沒有發(fā)現(xiàn)變異，而ProsperoS等于2001至2004年間分別在俄勒岡州的一片獨(dú)立森林的固定樣點(diǎn)以及俄勒岡州的苗圃里采集分析了292個(gè)病原菌種群的基因結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，在俄勒岡州的森林和苗圃之間缺乏基因交流，而且森林里的基因多樣性較低，在這4a里，森林里的多基因座基因型是非常普遍的，每年也會(huì)出現(xiàn)低層次的基因型。

BoutetX等利用微衛(wèi)星分析發(fā)現(xiàn)交配后代呈現(xiàn)出基因重新排列的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象要么是兩種親本(EU1×NA1)的等位基因重組，要么是在由雜合性向純合性轉(zhuǎn)移的過程中導(dǎo)致某一親本的等位基因的缺失(EU1×EU1)［5］。

MascherettiS等利用minimum-spanningnet-work方法分析了這些多基因座遺傳型(MGs)，發(fā)現(xiàn)一般的較常見的基因型分布在中間，而特殊的個(gè)體分散在各個(gè)枝端，這些特征與隨著本地進(jìn)化而進(jìn)化的少數(shù)普通基因型的集群現(xiàn)象相符合。他們還利用分子變異分析和空間自相關(guān)分析研究了病原菌的起源和現(xiàn)今的基因結(jié)構(gòu)，并利用一段非常小的樣本量分析了病原菌潛在的傳播方式［31］。

近年來，科學(xué)家們利用基于微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)的分子分析方法證實(shí)，分布在北美洲和歐洲的3種世系(EU1、NA1、NA2)分別簇集在3支獨(dú)立的進(jìn)化枝上［15，27，32］。第1支(EU1世系)包括歐洲分布的唯一無性系以及偶爾發(fā)現(xiàn)于北美洲苗圃，第2支(NA1世系)主要是分布在北美洲森林和苗圃的世系，第3支(NA2世系)僅存在于加利福尼亞州以及華盛頓州的少數(shù)苗圃里。

4P．ramorum對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響

P．ramorum對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響不僅體現(xiàn)在直接致死樹木上，還有許多間接影響。RizzoD等指出，許多很嚴(yán)重的影響并不會(huì)在短期內(nèi)體現(xiàn)出來，而是一個(gè)長(zhǎng)期的過程［33］。一些研究案例已經(jīng)體現(xiàn)出短期的間接影響。WaringK等研究發(fā)現(xiàn)，密花石櫟的致病死亡可以間接導(dǎo)致周圍紅杉林的生長(zhǎng)速率增加［34］。也有很多研究根據(jù)現(xiàn)今的觀測(cè)數(shù)據(jù)和重建技術(shù)證明了短期影響并推測(cè)出了未來狀況，例如，RamageB等利用此方法調(diào)查了P．ramorum對(duì)紅杉林特有構(gòu)型的影響［35］。P．ramorum對(duì)生態(tài)環(huán)境的長(zhǎng)遠(yuǎn)影響也可以從經(jīng)歷過林木死亡慘重地區(qū)的再生模式推測(cè)出來?，F(xiàn)今的再生模式需要考慮哪些樹種可以取病地區(qū)的密花石櫟，過渡期對(duì)發(fā)病的森林來說很重要，尤其是那些樹種多樣性很低的森林類型(比如紅杉林)。RamageB等綜合調(diào)查了受P．ramorum影響的森林再生過程，發(fā)現(xiàn)在密花石櫟死亡的地區(qū)，并沒有其它闊葉樹種可以替代密花石櫟。另外，某些受害嚴(yán)重的地塊缺乏足夠的樹種占據(jù)可利用的生長(zhǎng)空間。他們?cè)谡{(diào)查中發(fā)現(xiàn)了不適當(dāng)?shù)脑偕Ｊ剑钸m當(dāng)?shù)脑偕Ｊ讲]有顯現(xiàn)［36］。需要注意的是，此研究?jī)H設(shè)了一個(gè)研究區(qū)域(加拿大的馬林郡)，仍需后續(xù)研究的補(bǔ)充才能在更寬泛的尺度上得以論證。

5野外和苗圃防治

目前，雖然有各種方法可以降低P．ramorum的影響，但并沒有一項(xiàng)可以確保消除此病原菌，甚至難以確保1株樹免受其害。由于林分類型不一，同一種方法不可能適用于所有的森林類型，民眾接受程度以及財(cái)政負(fù)擔(dān)程度也是一些舉措能否成功應(yīng)用的決定性因素。但是，如果認(rèn)真、徹底地采取某些措施，是可以減緩病原菌的傳播速度，降低病原菌對(duì)樹木危害的。

5．1野外防治

在美國(guó)的俄勒岡州，人們基于景觀和地區(qū)水平開展對(duì)P．ramorum的防治管理工作，以徹底根除所在林地發(fā)現(xiàn)的病原菌。措施包括:飛機(jī)偵測(cè)和水道監(jiān)控等一系列的前期檢測(cè);由美國(guó)農(nóng)業(yè)部動(dòng)植物衛(wèi)生檢疫局和俄勒岡州農(nóng)業(yè)部共同領(lǐng)導(dǎo)檢疫，以阻止本地區(qū)的染病寄主材料移出;一旦發(fā)現(xiàn)有樹木感染，不管有沒有產(chǎn)生癥狀，立即移除，并在每一個(gè)受侵染的樹木周圍設(shè)立91.44m的緩沖區(qū)。

5．1．1栽培技術(shù)

SwieckiT等做了一項(xiàng)研究，如果在一棵禾葉櫟周圍5m范圍內(nèi)栽種月桂樹，即可有效預(yù)測(cè)疾病風(fēng)險(xiǎn)，降低橡樹受侵害的可能。這為采用改變?cè)耘嗉夹g(shù)的方法幫助林木抵抗P．ramorum提供了強(qiáng)有力證據(jù)［37］。

5．1．2化學(xué)防治

GarbelottoM等對(duì)健康的櫟樹和密花石櫟使用亞磷酸鹽殺真菌劑處理，效果良好［38］。亞磷酸鹽并非直接作用于疫霉屬病原菌，而是通過注射至樹干或直接噴灑在樹干表面促使樹木產(chǎn)生各種各樣的免疫反應(yīng)，對(duì)生態(tài)環(huán)境無任何污染。

5．1．3造林方式

ValachovicY等在美國(guó)加州西北海岸的洪堡郡做了一個(gè)試驗(yàn)，通過改變?cè)炝址绞絹矸乐蜳．ramorum［39］。在受侵染的林分設(shè)置許多重復(fù)試驗(yàn)，通過鋸割并轉(zhuǎn)移密花石櫟和月桂樹來降低潛在的菌株密度。這是美國(guó)加州第一次基于林分水平的大規(guī)模造林試驗(yàn)的嘗試。

5．2苗圃防治

5．2．1化學(xué)防治

針對(duì)重要的觀賞植物和圣誕樹進(jìn)行了多種化學(xué)藥劑防治試驗(yàn)—P．ramorum的主要4屬寄主植物，即杜鵑屬、山茶屬、莢蒾屬和馬醉木屬。精甲霜靈、甲霜靈、烯酰嗎啉、咪唑菌酮4種最有效。多種研究表明:化學(xué)藥劑一般只能起到預(yù)防作用，并不能根除病原菌，需要重復(fù)間隔使用，而且掩飾病害癥狀、影響檢疫，長(zhǎng)期使用病原菌會(huì)產(chǎn)生抵抗力［40］。

5．2．2灌溉用水

如果灌溉用水的源頭是溪流，則有可能被森林里的病原菌侵染，很多研究的焦點(diǎn)集中在根除灌溉用水中含有的P．ramorum菌株。WerresS等設(shè)立了一個(gè)水再循環(huán)模擬系統(tǒng)，用2a的時(shí)間研究P．ramorum在不同季節(jié)水中的存活率與感染率［41］。容器育苗的苗圃把容器里的再循環(huán)水作為灌溉用水，研究病原菌在水中的傳染病學(xué)是非常重要的，這項(xiàng)研究可以了解P．ramorum在水中可能的傳播方式。UferT等在德國(guó)做了3種類型的過濾實(shí)驗(yàn):慢砂濾池法、熔巖過濾法、人工濕地法，結(jié)果表明，前兩種方法可以完全濾除P．ramorum菌株，人工濕地法仍有37%的水樣含有病原菌［42］。

5．2．3土壤滅菌

盡管P．ramorum在土壤中的存活時(shí)間還沒有確定，但是掌握病原菌在苗圃土壤里的分布并對(duì)侵染區(qū)隔離治理卻十分必要。大量的化學(xué)藥劑(三氯硝基甲烷、甲胺磷、碘甲烷和棉隆)篩選試驗(yàn)表明，當(dāng)受侵染的土壤放入玻璃容器時(shí)，所有藥品都是有效的。棉隆煙熏法14d可以根除自然環(huán)境下苗圃土壤剖面的病原菌［43］。蒸汽消毒和日曬等其它的土壤滅菌法也在研究中。對(duì)苗圃內(nèi)防治P．ramorum的研究已經(jīng)從個(gè)體植株擴(kuò)展到苗圃環(huán)境、病原菌隨植株跨州乃至跨國(guó)傳播等領(lǐng)域。鑒于該病菌的危害和傳播途徑，對(duì)于地區(qū)與國(guó)家之間的觀賞植物貿(mào)易往來，一定要建立一個(gè)穩(wěn)定健全的檢驗(yàn)檢疫機(jī)制。

6問題與討論

直到現(xiàn)在，對(duì)P．ramorum起源的地理中心仍然不清楚。有學(xué)者認(rèn)為起源于美國(guó)本土［44－45］，但更多的學(xué)者傾向于源自中國(guó)云南、喜馬拉雅山脈的東部或者臺(tái)灣［46］。另外，因?yàn)槊總€(gè)國(guó)家或地區(qū)的自然條件不同，各國(guó)尚未建立一套對(duì)P．ramorum成熟、穩(wěn)定的檢測(cè)方法。美國(guó)和歐盟已經(jīng)制定出P．ramorum的檢疫標(biāo)準(zhǔn)，但隨著對(duì)病原菌研究的深入，這些標(biāo)準(zhǔn)一直在調(diào)整之中，而且在許多方面有差異。

P．ramorum的寄主十分廣泛，對(duì)針、闊葉樹，喬、灌木，成熟林或苗木，都可侵染危害。迄今為止，在自然界被P．ramorum侵染并通過柯赫氏法則(Koch’sPostulates)證明的寄主植物有45種，有82種相關(guān)寄主植物是在自然界發(fā)病、經(jīng)分離培養(yǎng)或PCR分子技術(shù)檢測(cè)到P．ramorum，但未通過柯赫氏法則證明，還有許多植物已通過人工接種試驗(yàn)發(fā)病［47］。中國(guó)幅員遼闊，樹種繁多，多數(shù)寄主植物都有分布。鑒于P．ramorum傳入、定殖以及擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)性相當(dāng)大，每個(gè)國(guó)家和地區(qū)都要做好相應(yīng)的檢疫及防范措施，加大科研投入，以有效控制該病原菌對(duì)全世界造成的危害。