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本文作者：王彥、孟祥晨、王麗群、李馨單位：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室

雙歧桿菌是人和動(dòng)物腸道最常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性有益細(xì)菌,約占人體腸道可培養(yǎng)微生物的10%。雙歧桿菌屬的微生物是應(yīng)用較多的益生菌之一,在食品中通常通過(guò)添加于乳制品進(jìn)行食用消費(fèi)。研究表明,雙歧桿菌可以通過(guò)平衡腸道菌群維持機(jī)體的整體健康水平。雙歧桿菌經(jīng)食用進(jìn)入體內(nèi),發(fā)揮益生功能的先決條件是其在腸道的黏附與定植,例如黏附能夠縮短痢疾持續(xù)時(shí)間[1],刺激免疫應(yīng)答[23],競(jìng)爭(zhēng)排斥病原微生物[4]等,因此,黏附腸道能力是篩選益生菌的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)。雙歧桿菌被攝食后,在未達(dá)到腸道前會(huì)經(jīng)歷胃的酸性環(huán)境,而人體胃液的酸度很強(qiáng),通常的pH為3.0,空腹或食用酸性食品時(shí)可達(dá)1.5,食用堿性食物時(shí)可達(dá)4.05.0[5],雙歧桿菌經(jīng)歷該酸性環(huán)境后,其黏附作用會(huì)受何影響還不清楚。因此,本文將主要探討不同pH的酸性環(huán)境對(duì)雙歧桿菌黏附能力的影響。由于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)實(shí)施困難,體外細(xì)胞培養(yǎng),尤其是人結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞,可作為模型用于分析菌株的黏附[67]。另外,有研究表明雙歧桿菌的黏附能力與細(xì)菌表面組成及結(jié)構(gòu)直接相關(guān),所以菌體表面的物理化學(xué)性質(zhì)也可以間接反應(yīng)菌體的黏附能力,菌體細(xì)胞表面的物理化學(xué)特征主要取決于其表面疏水性和自動(dòng)聚集能力,Pan等[8]通過(guò)對(duì)23株雙歧桿菌疏水性和黏附能力進(jìn)行比較分析,建立了能夠反映雙歧桿菌表面疏水性與黏附性之間關(guān)系的回歸方程(R2=0.78),疏水性越強(qiáng)的菌株黏附能力越強(qiáng)。王麗群等[9]測(cè)定了7株雙歧桿菌表面疏水性和自動(dòng)聚集能力,同時(shí)觀察了雙歧桿菌的黏附能力,結(jié)果表明,雙歧桿菌的黏附能力、自動(dòng)聚集能力及表面疏水性具有一定的正相關(guān)性。因此,在評(píng)價(jià)低pH處理對(duì)菌株黏附性影響時(shí),本研究同時(shí)確定對(duì)菌體自動(dòng)聚集能力和表面疏水性的影響。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)菌種:兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603分離自成人糞便,由乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室凍干保藏。

1.1.2供試細(xì)胞:Caco-2(Humancolonadenocar-cinoma,人結(jié)腸腺癌細(xì)胞),其特征是能夠體外模擬成熟上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能特征,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng):從液氮罐中取出Caco-2細(xì)胞,將凍存管迅速置于37°C水浴中復(fù)蘇細(xì)胞,離心收集細(xì)胞后,加入4mL含10%胎牛血清(使用前56°C滅活30min)的DMEM培養(yǎng)基,在37°C、5%CO295%空氣的條件下培養(yǎng),每隔一天更換培養(yǎng)液;當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶底長(zhǎng)至80%時(shí),需進(jìn)行傳代。用于黏附測(cè)定的Caco-2細(xì)胞,單層細(xì)胞培養(yǎng)于預(yù)先放有玻璃蓋玻片的六孔培養(yǎng)皿,接種量為1×105CFU/mL,每隔48h及進(jìn)行黏附試驗(yàn)前24h更換一次培養(yǎng)基,維持細(xì)胞生長(zhǎng)。單層細(xì)胞培養(yǎng)1517d,后期融合后,即可用于黏附試驗(yàn)。

1.2.2菌種的活化與傳代:兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603接入mMRS液體培養(yǎng)基,37°C條件下厭氧(80%N2、10%H2、10%CO2,下同)培養(yǎng)48h;在mMRS固體培養(yǎng)基上劃線,37°C條件下厭氧培養(yǎng)48h,鏡檢后挑取固體培養(yǎng)基中形態(tài)良好,沒(méi)有雜菌的菌落,接入mMRS液體培養(yǎng)基中,37°C條件下厭氧培養(yǎng)48h,經(jīng)過(guò)兩代液體培養(yǎng)以提高菌株活力。

1.2.3雙歧桿菌經(jīng)不同pH的PBS溶液處理后存活率的測(cè)定:將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期的細(xì)菌培養(yǎng)物8000g離心10min,收集菌體,菌體經(jīng)PBS(pH7.2)清洗兩遍后重懸于pH為1.03.0(以0.5為梯度)的PBS中,37°C分別孵育0.5、1.0、1.5和2.0h,然后采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定其活菌數(shù),分別計(jì)為An,經(jīng)PBS處理前的活菌數(shù)計(jì)為A0,存活率(%)表示為:An-1/A0×100。同時(shí)以pH為7.0的PBS處理作對(duì)照。確定存活率變化最大的時(shí)間點(diǎn)為處理時(shí)間。

1.2.4不同pH的PBS溶液對(duì)雙歧桿菌的處理:將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期的細(xì)菌培養(yǎng)物8000g離心10min,收集菌體,菌體經(jīng)PBS(pH7.2)清洗兩遍后重懸于pH為1.05.0(以0.5為梯度)的PBS中于37°C處理0.5h,8000g離心10min,收集菌體,經(jīng)PBS(pH7.2)清洗兩遍后,收集菌體,再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)以pH為7.0的PBS處理作對(duì)照。1.2.5雙歧桿菌黏附性的測(cè)定:(1)直接鏡檢法測(cè)定雙歧桿菌的黏附能力。參考Gopal等[10]的方法,采用直接鏡檢法測(cè)定雙歧桿菌的黏附能力,具體步驟如下:將菌體濃度調(diào)整為1×108個(gè)細(xì)胞/mL,經(jīng)PBS溶液處理后重懸于DMEM培養(yǎng)基,用于黏附測(cè)定。Caco-2細(xì)胞用PBS(pH7.2)清洗后,添加2mL含雙歧桿菌的DMEM培養(yǎng)基,于37°C、5%CO2-95%空氣條件下孵育1h。單層細(xì)胞用無(wú)菌PBS緩沖液清洗5次,甲醇固定10min,革蘭氏染色,在顯微鏡油鏡下觀察細(xì)菌與細(xì)胞的黏附狀態(tài)。黏附能力以隨機(jī)選取的20個(gè)顯微視野進(jìn)行評(píng)價(jià),并以100個(gè)Caco-2細(xì)胞黏附的細(xì)菌數(shù)表示。(2)平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定雙歧桿菌的黏附率。參考Kos等[11]的方法,采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定雙歧桿菌的黏附能力,具體步驟如下:將菌體濃度調(diào)整為1×108個(gè)細(xì)胞/mL,經(jīng)PBS溶液處理后重懸于DMEM培養(yǎng)基,用于黏附測(cè)定。Caco-2細(xì)胞用PBS(pH7.2)清洗后,添加2mL含雙歧桿菌的DMEM培養(yǎng)基,37°C、5%CO2-95%空氣條件下,培養(yǎng)1h。單層細(xì)胞用無(wú)菌PBS(pH7.2)緩沖液清洗5次,以除去未黏附的細(xì)菌細(xì)胞,加入250μLTrypsine-EDTA(0.05%Tryp-sine,0.53mmol/LEDTA)于37°C培養(yǎng)15min,將黏附的細(xì)菌從細(xì)胞上釋放下來(lái)。然后向每個(gè)孔中添加250μL含10%胎牛血清的DMEM以終止胰酶活力,用吸管將Caco-2細(xì)胞層裂解下來(lái)。黏附細(xì)菌經(jīng)10倍系列稀釋后涂布于mMRS平板,做平行對(duì)照,37°C厭氧培養(yǎng),活菌數(shù)計(jì)為A1,黏附前的活菌數(shù)計(jì)為A0。黏附率(%)表示為:A1/A0×100。

1.2.6雙歧桿菌疏水性的測(cè)定:通過(guò)實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)碳?xì)浠衔锏挠H和力反映菌株表面疏水性,具體參考Rosenberg等[12]的方法,步驟如下:將PBS溶液處理后的菌體,用PBS緩沖液在600nm處調(diào)節(jié)吸光值為0.80.9(準(zhǔn)確讀取其吸光度值,記作A0)。取3mL該菌液,然后加入0.6mL十六烷。該兩相體系通過(guò)渦旋振蕩徹底混合2min,37°C共孵育1h后去除上清液,于600nm處測(cè)定水相的吸光值(記作A)。按如下公式計(jì)算實(shí)驗(yàn)菌株的疏水性[H(%)]:H(%)=[(A0A)/A0]×100,這里A0和A分別表示有機(jī)溶劑萃取前后的吸光值。進(jìn)行3次獨(dú)立的試驗(yàn)。

1.2.7雙歧桿菌自動(dòng)聚集能力的測(cè)定:菌株的自動(dòng)聚集能力以自動(dòng)聚集百分比表示,具體參考Collado等[13]的方法,方法如下:將PBS溶液處理后的菌體重懸于耗盡的mMRS培養(yǎng)基中,經(jīng)漩渦振蕩2min后,取1mL測(cè)定細(xì)菌懸浮液在600nm處的吸光值作為整個(gè)細(xì)菌懸浮液的吸光值,而后25°C靜止放置120min后,取1mL上層清液至另一試管中,在600nm處測(cè)其吸光值,通過(guò)以下公式計(jì)算自動(dòng)聚集百分比:1(上層清液吸光值/整個(gè)細(xì)菌懸浮液吸光值)×100。

1.3數(shù)據(jù)處理所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,運(yùn)用SPSSStatisticsV17.0軟件,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析(P<0.05),試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2結(jié)果與分析

2.1不同pH的PBS溶液處理后雙歧桿菌的存活率兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603經(jīng)不同pH的PBS溶液處理不同時(shí)間后,分別測(cè)定其存活率,結(jié)果見(jiàn)圖。由圖1可知:兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603在pH為1.0和1.5的PBS中處理0.5h后,已經(jīng)無(wú)法檢測(cè)到活菌;在pH為2.0的PBS中處理0.5h后,活菌數(shù)僅為6.85×104CFU/mL,并隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)活菌數(shù)逐漸下降,處理1.5h后幾乎檢測(cè)不到活菌;在pH為2.5的PBS溶液中處理0.5h后存活率為52.35%,并隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)活菌數(shù)逐漸下降;在pH3.0的PBS溶液中,在處理的2.0h內(nèi),活菌數(shù)并無(wú)明顯變化。綜合上述結(jié)果,確定兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603在不同pH的PBS溶液中的處理時(shí)間為0.5h時(shí)存活率變化最大。

2.2不同pH的PBS溶液處理對(duì)雙歧桿菌黏附性的影響

2.2.1采用直接鏡檢法獲得的結(jié)果:采用直接鏡檢法測(cè)定經(jīng)不同pH的PBS溶液處理后,兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603的黏附能力,結(jié)果如圖2所示。由圖2可知:兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603在pH7.0時(shí)的黏附性為260.90個(gè)/100個(gè)細(xì)胞;除pH5.0的處理組外,其余各組的黏附性均顯著低于對(duì)照組(P<0.05);pH1.5(黏附性為119.05個(gè)/100個(gè)細(xì)胞)和pH2.5(黏附性為111.02個(gè)/100個(gè)細(xì)胞)兩處理組的黏附能力最低,且顯著低于其余各處理組(P<0.05)。由圖1的結(jié)果可知:在pH為1.0和1.5條件下處理0.5h后,已經(jīng)檢測(cè)不到活菌,但此時(shí)仍有細(xì)菌黏附,說(shuō)明死菌體也具有一定的黏附能力。

2.2.2采用平板菌落計(jì)數(shù)法獲得的結(jié)果:由于直接鏡檢法無(wú)法區(qū)分黏附的死菌體和活菌體,因此采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定黏附的活菌體數(shù)量。圖3給出的是經(jīng)不同pH的PBS溶液處理后,兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603的黏附能力。由圖3可知:對(duì)照處理組(pH7.0)的黏附率最大,除pH5.0的處理組外,其余各處理組的黏附率均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。在pH為1.02.0的范圍內(nèi)未檢測(cè)到活菌,其黏附率為0;在pH為2.53.5的范圍內(nèi),隨pH升高,黏附率下降;在pH為4.05.0的范圍內(nèi),隨pH升高,黏附率逐漸升高。

2.3不同pH的PBS溶液處理對(duì)雙歧桿菌疏水性的影響圖4是兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603經(jīng)不同pH的PBS溶液處理后的表面疏水性。由圖4可知:兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603在pH7.0時(shí)的疏水性為77.16%;pH3.0(疏水性為88.69%)和pH3.5(疏水性為89.84%)兩處理組的疏水性顯著高于對(duì)照組(P<0.05),其余處理組與對(duì)照組無(wú)顯著差異。2.4不同pH的PBS溶液處理對(duì)雙歧桿菌自動(dòng)聚集能力的影響圖5是兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603經(jīng)不同pH的PBS溶液處理后的自動(dòng)聚集能力。由圖5可知:除pH1.0、1.5和5.0處理組外,其余各組均顯著低于對(duì)照組(pH7.0);在pH為1.03.0范圍內(nèi),隨pH的升高,自動(dòng)聚集能力逐漸降低;在pH為3.55.0范圍內(nèi),隨pH的升高,自動(dòng)聚集能力逐漸升高。

3討論

由于益生菌到達(dá)人體腸道發(fā)揮益生作用前,會(huì)經(jīng)歷胃酸等酸性環(huán)境[5],較低的酸性環(huán)境會(huì)對(duì)益生菌的存活造成一定影響,已有的研究表明[1415],雙歧桿菌的耐酸性具有種屬特異性,不同雙歧桿菌的脅迫致死pH不同。Liu等[16]用pH2.0的PBS來(lái)測(cè)定38株雙歧桿菌的存活率,發(fā)現(xiàn)處理90min時(shí)幾乎無(wú)存活,由本試驗(yàn)可以看出當(dāng)pH降低到3.0以下時(shí),會(huì)對(duì)雙歧桿菌的存活造成顯著影響(圖1)。這些酸性環(huán)境也可能會(huì)進(jìn)一步影響益生菌在人體內(nèi)的定植和其益生作用的發(fā)揮。本試驗(yàn)以高黏附能力菌株兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603為研究對(duì)象,針對(duì)不同pH的酸性環(huán)境對(duì)兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603黏附的影響進(jìn)行研究,以Caco-2細(xì)胞為模型,采用平板菌落計(jì)數(shù)法和直接鏡檢法對(duì)雙歧桿菌的黏附能力進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明,經(jīng)不同pH酸處理后的兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603黏附能力下降。經(jīng)非致死的酸性條件處理后,隨pH的增加,兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603黏附能力逐漸升高(圖2、3)。經(jīng)致死酸性條件處理后,黏附率有所下降,可能由活菌數(shù)下降所導(dǎo)致(圖2),同時(shí)實(shí)驗(yàn)證實(shí),酸處理的致死菌株也具有一定的黏附能力(圖3)。本研究證實(shí)酸性環(huán)境影響了實(shí)驗(yàn)菌株的黏附性,這種影響是不利的。許多報(bào)道指出,黏附是一個(gè)復(fù)雜的多步的過(guò)程,黏附過(guò)程分為非特異性結(jié)合階段和特異性黏附階段,非特異性結(jié)合是益生菌與細(xì)胞的黏附過(guò)程中乳酸菌產(chǎn)生的胞外多糖(EPS)起作用[17];特異性結(jié)合是黏附素與黏附素受體之間的特異性結(jié)合,有研究表明益生菌的膜蛋白和脂磷壁酸(LTA)介導(dǎo)乳酸菌與腸上皮細(xì)胞的特異性黏附[3,1819]。益生菌在低pH處理后膜脂質(zhì)會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化[20],同時(shí)產(chǎn)生相應(yīng)的酸應(yīng)激蛋白[21],可能會(huì)使菌體表面的黏附素發(fā)生變化,從而降低了菌體的黏附作用。此外,疏水作用被認(rèn)為是影響細(xì)菌與宿主間反應(yīng)的因素之一,與多種黏附現(xiàn)象,如組織表面的黏附、塑料表面的黏附、細(xì)菌間的集聚等均有關(guān)。細(xì)菌的疏水性源于菌體表面靜電荷、極性和非極性殘基的相對(duì)分布。雙歧桿菌表面疏水性和自動(dòng)聚集能力通常被認(rèn)為是兩個(gè)獨(dú)立的、能夠反映雙歧桿菌黏附能力的特征[22]。本研究同時(shí)對(duì)雙歧桿菌表面疏水性和自動(dòng)聚集能力進(jìn)行測(cè)定,分析酸處理后雙歧桿菌表面性質(zhì)和黏附能力之間的相關(guān)性。研究證實(shí),除pH為3.5處理組外,兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603的表面疏水性和黏附能力呈現(xiàn)很好的正相關(guān)性;除pH3.0的處理組外,兩歧雙歧桿菌KLDS2.0603的自動(dòng)聚集能力和黏附能力呈現(xiàn)較好的正相關(guān)性。對(duì)于pH為3.0和3.5處理組所呈現(xiàn)的非正相關(guān)性,分析原因可能在于pH3.0和3.5是致死pH向非致死pH的過(guò)度,pH對(duì)菌體表面靜電荷的影響不同,或不同程度上改變了菌體表面極性和非極性殘基的相對(duì)分布,但這些因素的改變是否是引起黏附能力改變的主要因素,還有待進(jìn)一步的證實(shí)。