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本文作者：唐潔1,2王海燕1,2徐巖1,2

作者單位：1.食品科學與技術國家重點實驗室2.江南大學

傳統(tǒng)固態(tài)白酒的發(fā)酵是一個復雜的多種微生物生物轉化的過程,酵母在其中起著重要作用。根據(jù)酵母的作用,大致可將酵母分成兩大類。一類是Saccharomycescerevisiae,主要完成酒精發(fā)酵,具有較高的發(fā)酵速率和完全的發(fā)酵能力。另一類是non-Saccharomyces,雖然其發(fā)酵效率較低,但能夠合成多種酶,將原料中的前體物質轉換成風味物質如酯、酸、高級醇和醛等產(chǎn)物,對發(fā)酵食品風味、質地和色澤的形成有著重要的作用。并且還能抑制發(fā)酵過程中一些腐敗微生物的繁殖[13]。與單獨培養(yǎng)相比,酵母的混菌發(fā)酵,能表現(xiàn)出更好的特性。它們或者代謝產(chǎn)生、增強一些有益的風味化合物如苯乙醇、乙酸苯乙酯等,或者降解某些異味物質如乙酸、乙醛等,或者促進酵母的代謝性能,從而最終改變發(fā)酵產(chǎn)物的風味特征[45]。所以將釀酒酵母和非釀酒酵母共同作為發(fā)酵起始菌種,為豐富發(fā)酵產(chǎn)物的風味復雜性和增強風格的獨特性提供了一條有效的途徑[67]。在詳細剖析葡萄酒發(fā)酵中的微生物組成后,研究的熱點之一就是釀酒酵母與非釀酒酵母組合發(fā)酵中酵母之間的相互影響和代謝產(chǎn)物的差異分析。白酒生產(chǎn)具有自身特殊的原料、工藝和微環(huán)境,需要重新認識白酒中釀酒酵母與非釀酒酵母在生理和代謝水平上的相互作用。已發(fā)現(xiàn)的非釀酒酵母主要包括Pichia、Saccharomycopsis、Issatchenkia、Candida、Hanseniaspora[8]。畢赤類酵母是主要的產(chǎn)酯酵母,對白酒的風味有重要貢獻。其中,Pichiaanomala是白酒中普遍存在的菌種。異常畢赤酵母能耐受低pH、低水活度、高滲透壓、厭氧等極端環(huán)境。相比有氧,限氧條件不僅能夠誘導異常畢赤酵母進行酒精發(fā)酵,激活發(fā)酵途徑中的關鍵酶,而且對葡萄糖的吸收率和乙醇、甘油、乙酸乙酯等代謝物含量都有所增加[910]。國內(nèi)學者雖然對酵母的產(chǎn)酯作用進行了諸多研究,但主要針對實驗室條件下單菌種的優(yōu)化[11],在釀酒環(huán)境中酵母產(chǎn)酯和酒精發(fā)酵的相互影響及協(xié)調作用研究很少。雖然白酒生產(chǎn)是固態(tài)發(fā)酵,但在實驗室條件下模擬白酒固態(tài)發(fā)酵工藝,存在著發(fā)酵、菌體生長、營養(yǎng)物的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌在各處的不均勻性,以及明顯的濃度梯度及傳熱、傳質困難,使得發(fā)酵參數(shù)的檢測和控制比較困難。因此本研究嘗試在限氧條件下先實現(xiàn)釀酒酵母和異常畢赤酵母的混菌液態(tài)發(fā)酵,實現(xiàn)不同種屬酵母的組合發(fā)酵,并初步分析兩株酵母之間的相互作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種:釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和異常畢赤酵母(Pichiaanomala)為本實驗室從酒醅中分離到的菌株,兩株菌采用麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基斜面保養(yǎng)。

1.1.2培養(yǎng)基:種子培養(yǎng)基為麥芽汁培養(yǎng)基;發(fā)酵培養(yǎng)基為麩皮汁培養(yǎng)基[12]。

1.1.3試劑及藥品:2-辛醇(2-Octanol)、4-甲基-2-戊醇(4-Methyl-2-pentanol)購自Sigma公司。其他試劑均為國產(chǎn)色譜純或分析純,購于上海生工生物工程公司。

1.2方法

1.2.1液態(tài)發(fā)酵方式:將異常畢赤酵母和釀酒酵母單獨接種麩皮汁培養(yǎng)基,搖瓶培養(yǎng)1d后,按107CFU/mL接種量接入100mL麩皮汁培養(yǎng)基中于30°C靜置培養(yǎng)6d。兩株酵母混合發(fā)酵是采用兩種方式接種:①分別單獨液態(tài)培養(yǎng)1d后,按照1:1比例接種(混合接種);②根據(jù)兩種酵母的生長曲線,由于異常畢赤酵母生長較為緩慢,需要近10h才能達到與釀酒酵母相同的生長量。故麥芽汁培養(yǎng)基中先接種異常畢赤酵母,培養(yǎng)10h,再接入釀酒酵母(順序接種)。種子液搖瓶培養(yǎng)1d后,按107CFU/mL接種量接入麩皮汁培養(yǎng)基于30°C培養(yǎng)箱中恒溫靜置培養(yǎng)6d。每隔24h取樣,測定不同培養(yǎng)方式下發(fā)酵液的理化指標、酵母的發(fā)酵性能和產(chǎn)酯能力,跟蹤發(fā)酵過程中兩種酵母數(shù)量變化趨勢;并檢測發(fā)酵結束時發(fā)酵液的風味物質。

1.2.2發(fā)酵液理化指標的測定:pH測定采用METTLERTOLEDOpH計,還原糖采用DNS法測定[13]。發(fā)酵結束后發(fā)酵液中乙醇、葡萄糖用HPLC測定[14]。乙醇理論轉化率=乙醇濃度/(0.51×還原糖濃度)×100%,其中糖轉換為乙醇的換算系數(shù)為0.51[15]。

1.2.3酵母計數(shù):因為兩種酵母在YPD平板上的形態(tài)不同,直接采用稀釋涂布YPD平板測定發(fā)酵過程中兩種酵母的數(shù)量變化。

1.2.4酵母發(fā)酵性能:采用CO2失重法。每隔24h稱重一次,直至發(fā)酵結束。

1.2.5乙酸乙酯的檢測:采用液-液微萃取法提取和氣相色譜-氫火焰離子化檢測器(GC-FID)定量分析。取5mL發(fā)酵液于離心管中,加入5μL內(nèi)標(2-辛醇)溶液和500μL乙醚。充分混勻后靜置分層,取有機相進行分析(儀器為安捷倫6890N氣相色譜儀配有氫火焰離子化檢測器FID)。色譜條件見文獻[16]。

1.2.6發(fā)酵液中風味物質的分析:運用頂空固相微萃取技術(HS-SPME)和氣相色譜-質譜(GC-MS)方法分析。樣品處理方法及GC-MS分析條件見文獻[17]。

1.2.7無細胞濾液對酵母生長的影響:麩皮汁中發(fā)酵4d酵母發(fā)酵液,離心收集上清,0.22μm微孔膜過濾除菌獲得無細胞濾液[18]。在無細胞濾液中添加等體積的葡萄糖溶液和新鮮麩皮汁培養(yǎng)基。將培養(yǎng)好的酵母(107CFU/mL)接入上述培養(yǎng)基中,于30°C靜置培養(yǎng)24h后測OD600。對照分別為酵母接入不接種麩皮汁培養(yǎng)基+新鮮麩皮汁培養(yǎng)基(1:1)和不接種麩皮汁培養(yǎng)基+葡萄糖溶液(1:1)。

2結果與討論

2.1酵母數(shù)量的動態(tài)變化及發(fā)酵性能的測定

發(fā)酵過程中酵母總數(shù)的動態(tài)變化見圖1。發(fā)酵前48h,酵母處于快速生長階段,在4896h保持較高數(shù)量,此后數(shù)量緩慢減少。釀酒酵母和異常畢赤酵母單菌種培養(yǎng)時細胞數(shù)可達到1.6×108CFU/mL和8.3×107CFU/mL,而混菌發(fā)酵時細胞量最大也能達到108CFU/mL。畢赤酵母單獨培養(yǎng)時細胞數(shù)一直位于最低水平?；炀l(fā)酵時,由于釀酒酵母的存在,體系中酵母總數(shù)很快達到較高水平?；炀l(fā)酵過程中兩種酵母數(shù)量的動態(tài)變化過程見圖2。順序接種混菌培養(yǎng)時異常畢赤酵母數(shù)量始終高于混合接種混菌培養(yǎng),而釀酒酵母情況卻相反。由于混菌發(fā)酵時兩種酵母競爭利用碳源,釀酒酵母優(yōu)先利用葡萄糖而迅速增殖,異常畢赤酵母營養(yǎng)不足導致生長緩慢,故混合接種時釀酒酵母數(shù)量較高。當異常畢赤酵母先單獨培養(yǎng)時,沒有競爭壓力,生長到一定的生物量后再接入釀酒酵母,使兩種酵母共同繁殖,獲得較高的細胞水平。所以,順序接種時異常畢赤酵母數(shù)量較高。這與葡萄酒中釀酒酵母與非釀酒酵母混菌發(fā)酵的結果相一致[19]。此外,當兩種酵母在同一體系中共同發(fā)酵時,由于營養(yǎng)物質和生存空間的限制,各自的最大生物量都低于單菌種培養(yǎng)的水平[1920]。普遍認為在與釀酒酵母混合發(fā)酵時,非釀酒酵母會抑制釀酒酵母的發(fā)酵性能[20]?；炀l(fā)酵的結果也驗證了這一觀點。如圖3所示,順序接種混合發(fā)酵時異常畢赤酵母的存在,主要是降低了起始階段的發(fā)酵速度,48h后發(fā)酵速度恢復到單菌種的水平。而混合接種發(fā)酵整個系統(tǒng)的發(fā)酵能力與釀酒酵母單菌種培養(yǎng)相近,CO2失重兩者之差不超過2g。單菌種培養(yǎng)與混菌發(fā)酵中乙酸乙酯濃度的變化規(guī)律見圖4。發(fā)酵48h時乙酸乙酯含量都達到峰值,最高為1.5g/L(順序混菌接種)。釀酒酵母產(chǎn)酯能力很弱,發(fā)酵液中乙酸乙酯濃度始終低于0.05g/L。由于混合接種混菌發(fā)酵中異常畢赤酵母的數(shù)量偏低,所以發(fā)酵液中乙酸乙酯也較低。雖然順序接種混菌發(fā)酵中異常畢赤酵母數(shù)量低于該酵母單菌種培養(yǎng),但發(fā)酵后期前者發(fā)酵液中乙酸乙酯含量更高。這可能是由于釀酒酵母的存在,提高了發(fā)酵液中乙醇濃度,促進非釀酒酵母的酯合成活性[21]。根據(jù)發(fā)酵體系重要的功能參數(shù)——發(fā)酵力和乙酸乙酯含量判斷,順序接種混菌發(fā)酵方式中兩種酵母都能達到較高的生物量,完成酒精發(fā)酵,合成了大量的乙酸乙酯。

2.2發(fā)酵過程理化指標動態(tài)變化

發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH的變化如圖5A所示。發(fā)酵1d時pH急劇下降,23d中pH值逐步上升,此后基本維持不變。單菌種與混菌發(fā)酵pH值的變化趨勢一致。發(fā)酵初期酵母形成乙酸等酸性物質,導致pH的降低。經(jīng)過初期的繁殖,酵母轉入酒精發(fā)酵階段,其分泌的蛋白酶水解蛋白質生成氨基酸,氨基酸脫氨作用生成NH3。并且發(fā)酵液中酒精濃度不斷上升,造成pH值的上升[22]。發(fā)酵結束時,兩種混菌方式和單菌種發(fā)酵各自pH值變化不大。還原糖是判斷酵母生長的重要指標。由圖5B可見,酵母的生長需利用還原糖,還原糖含量迅速下降。發(fā)酵48h時,混菌發(fā)酵和釀酒酵母單獨培養(yǎng)時發(fā)酵液中還原糖含量已降至10g/L左右。而異常畢赤酵母單獨培養(yǎng)時,生長速度緩慢,需發(fā)酵72h后還原糖才降至10g/L左右。隨后,酵母數(shù)量緩慢減少,還原糖含量趨于平穩(wěn)。

2.3發(fā)酵產(chǎn)物相關指標分析

發(fā)酵6d后,比較了混菌與單菌種發(fā)酵時相關理化指標的差異。由表1可知,異常畢赤酵母單獨培養(yǎng)時乙醇含量較低,乙酸乙酯含量為0.41g/L;釀酒酵母發(fā)酵液中乙醇濃度為22.20g/L,乙酸乙酯濃度僅有0.03g/L。所以,異常畢赤酵母與釀酒酵母分別具有較好的產(chǎn)酯和酒精發(fā)酵能力。組合兩種酵母進行混菌發(fā)酵,影響了整體的酯合成和酒精發(fā)酵水平。從殘?zhí)呛推咸烟菨舛瓤梢钥闯?混菌發(fā)酵時酵母對糖的利用程度與釀酒酵母相當。雖然順序接種混菌發(fā)酵的乙醇濃度和理論轉化率比釀酒酵母單獨培養(yǎng)時降低了約10%,但乙酸乙酯產(chǎn)量增加顯著,比異常畢赤酵母純種發(fā)酵時乙酸乙酯含量提高了近80%。因此,順序接種混菌發(fā)酵保證了發(fā)酵的可行性。

2.4發(fā)酵液中風味物質的分析

酵母在發(fā)酵過程中能代謝產(chǎn)生一些次級代謝產(chǎn)物,如高級醇類、酸、酯等,這些物質對白酒的風味具有重要的貢獻作用。因此,用GC-MS測定了發(fā)酵液中主要的風味物質。測定結果見表2(因檢測到的醛、酮類物質含量極低,數(shù)據(jù)未列出)。酸類物質中以乙酸為主。乙酸是非釀酒酵母代謝的副產(chǎn)物,含量過高會形成異味[23]。異常畢赤酵母單獨培養(yǎng)時產(chǎn)生的乙酸含量最多,是釀酒酵母的3.25倍。乙酸是合成酯的前體物質,混菌時異常畢赤酵母能將較多的酸轉化成酯。所以,混菌發(fā)酵有效地減少了乙酸濃度。高級醇主要是酵母繁殖的過程中形成的,釀酒酵母合成高級醇的能力強于非釀酒酵母。單菌種培養(yǎng)時,釀酒酵母產(chǎn)生的高級醇是異常畢赤酵母的2.43倍。與釀酒酵母單獨培養(yǎng)時相比,混合接種發(fā)酵時高級醇含量提高了28%。推測可能是非釀酵母在發(fā)酵后期的自溶,為釀酒酵母提供營養(yǎng)物質。或者非釀酒酵母具有某些酶活,能夠為釀酒酵母提供營養(yǎng)來源[23]。但順序接種發(fā)酵的高級醇含量卻降低了31%。這不僅與發(fā)酵體系中酵母的數(shù)量有關,而且可能是由于非釀酒酵母將高級醇轉化成酯類物質[24]。發(fā)酵液中酯類物質主要是醋酸酯和乙酯,它們都是白酒中重要的風味物質。釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生了較多的乙醇,異常畢赤酵母以酯酶合成途徑將醇和酸轉化為酯[21]。所以混合發(fā)酵中總酸和高級醇含量都相對較低,酯類相對較高。4種發(fā)酵液中檢測出的主要醋酸酯為乙酸乙酯和乙酸苯乙酯,異常畢赤酵母純種發(fā)酵、釀酒酵母純種發(fā)酵、順序接種混合發(fā)酵和混合接種混菌發(fā)酵中乙酸酯總和分別占相應總酯含量的52.53%、27.67%、66.08%和65.55%。相比單菌種發(fā)酵,混菌發(fā)酵有效地提高了發(fā)酵液中醋酸酯。發(fā)酵體系中有機酸含量低,使得混菌和單菌種發(fā)酵時其他乙酯類的含量都偏低。

2.5無細胞系統(tǒng)酵母菌相互影響觀察

在混菌發(fā)酵時,酵母會競爭利用有限的營養(yǎng)物質(主要是碳源),也會分泌代謝產(chǎn)物抑制或誘導其他真菌的死亡[10,25]。鑒于碳源和代謝物對酵母的抑制作用,將酵母菌株培養(yǎng)在麩皮汁/葡萄糖溶液+酵母無細胞濾液中,以無細胞濾液/對照組的生長相對值來表示酵母生長受抑制的程度。由表3可知,在無細胞濾液中添加麩皮汁時,釀酒酵母的生長受到一定程度的抑制;但添加葡萄糖溶液時,基本未表現(xiàn)出抑制效應。說明兩種酵母的代謝產(chǎn)物對釀酒酵母都無生長抑制作用,碳源是影響釀酒酵母繁殖的重要因素。而對于異常畢赤酵母,不管是添加麩皮汁還是葡萄糖,該酵母都受到了無細胞濾液的抑制,且抑制程度處于相似水平。因此,代謝物抑制作用是影響異常畢赤酵母生長的主要因素。3結論與展望本實驗在限氧條件下以谷物為培養(yǎng)基,采用釀酒酵母與異常畢赤酵母的混合發(fā)酵,分析其對發(fā)酵效率和風味物質的影響。異常畢赤酵母易受自身和釀酒酵母代謝物的抑制,生長較為緩慢。故混菌發(fā)酵時采用順序接種混菌培養(yǎng),使異常畢赤酵母先開始繁殖,削弱了代謝抑制作用,使異常畢赤酵母生長速率提高,此后再接種釀酒酵母。由于酵母之間對營養(yǎng)物質和生存空間的競爭性利用和酵母代謝產(chǎn)物的抑制作用,導致兩株酵母生物量都未達到各自純培養(yǎng)時的水平。但發(fā)酵結束時,整體發(fā)酵水平下降不到10%,乙酸乙酯含量提高了80%。因此,混菌發(fā)酵時雖然酵母數(shù)量減少,但細胞代謝活性卻增加。混合發(fā)酵時,釀酒酵母增加了發(fā)酵液中乙醇含量,底物濃度的增加隨之促進了酯的合成。發(fā)酵結束時風味物質的測定結果表明,順序接種混菌發(fā)酵能有效地利用發(fā)酵液中的酸類物質和高級醇,合成更多的酯類化合物。葡萄酒發(fā)酵過程中,在起始階段存在較高數(shù)量的Non-Saccharomyces,此后釀酒酵母開始繁殖。釀酒酵母產(chǎn)生蛋白類代謝物抑制Non-Saccharomyces的生長,Non-Saccharomyces的數(shù)量迅速下降[25]。但模擬白酒生產(chǎn)條件進行酵母的混合發(fā)酵時,釀酒酵母主要是抑制了起始異常畢赤酵母的生長,發(fā)酵過程中異常畢赤酵母仍能維持較高水平,直至發(fā)酵結束。因此,長期白酒環(huán)境的馴化、以及不同的原料和發(fā)酵條件可能改變了酵母的生長、代謝特性,白酒中酵母的相互作用具有自身的特殊性,需要進行深入的探索。

綜上所述,將釀酒酵母與非釀酒酵母進行混菌發(fā)酵,在保證酵母釀造性能不變的前提下,對于提高發(fā)酵產(chǎn)品的風味特征具有明顯的作用。酵母之間的生長抑制和微量組分協(xié)同合成作用,將影響發(fā)酵過程中酵母的生長性能和產(chǎn)品的風格特征。酵母的相互作用為工業(yè)條件的優(yōu)化提供了依據(jù)。