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本文作者：朱斐1呂夢園1許梓榮2作者單位：1浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院2浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院

結(jié)果與分析

1WSSV感染后螯蝦的死亡率及PCR檢測結(jié)果

WSSV口服感染螯蝦15d后，投喂病蝦組螯蝦的死亡率達(dá)到90%。而對照組未出現(xiàn)死亡。PCR檢測結(jié)果顯示投喂病蝦組的病毒陽性檢出率為100%(30/30)，而陰性對照組的陽性檢出率為0%(0/20)。死亡率=死亡個(gè)數(shù)/總個(gè)數(shù)×100%。PCR檢測結(jié)果顯示，病死螯蝦的肝胰腺、中腸、肌肉、鰓、性腺、淋巴六種組織的PCR結(jié)果均為WSSV陽性，而對照組健康螯蝦的各組織PCR檢測結(jié)果均為陰性。光鏡和電鏡觀察也發(fā)現(xiàn)與健康螯蝦比較病死螯蝦的肝胰腺、中腸、肌肉、鰓、性腺、淋巴等組織均發(fā)生了不同程度的病變并發(fā)現(xiàn)有WSSV病毒粒子存在。

2組織病理學(xué)分析

對照組健康螯蝦肝小管外壁由單層扁平細(xì)胞包圍，各肝小管之間有結(jié)締組織與脂肪組織包裹與分隔，并伴有血管分布(圖2a-1)。攻毒瀕死螯蝦的肝胰腺組織病理學(xué)變化十分明顯，光鏡下可見肝胰腺組織廣泛受損，吸收與分泌細(xì)胞大量地解體并空泡化(圖2a-2)。肝小管的管腔擴(kuò)大或破裂，肝小管之間的結(jié)締組織發(fā)生缺失，脂肪細(xì)胞大量溶解，血管大多破碎。對照組健康螯蝦的肌肉組織肌纖維規(guī)則均勻，細(xì)胞核大小一致分布均勻，未發(fā)現(xiàn)異常癥狀(圖2b-1)。而攻毒瀕死螯蝦的肌肉組織呈現(xiàn)波浪化紋理，細(xì)胞核大量減少，且固縮變形(圖2b-2)。健康螯蝦的中腸內(nèi)壁為高柱狀上皮組織，具纖毛刷狀緣，腸內(nèi)壁向腸腔突起許多皺褶。肌肉層與腸內(nèi)壁之間有大量結(jié)締組織與脂肪組織填充(圖2c-1)。與健康螯蝦的中腸組織相比，攻毒后瀕死螯蝦的中腸組織病變主要表現(xiàn)為腸內(nèi)壁高型柱狀上皮組織嚴(yán)重?fù)p傷和壞死，上皮細(xì)胞大量萎縮、細(xì)胞核大量減少，脫落高型柱狀上皮組織與結(jié)締組織相剝離，攻毒后期腸腔中可發(fā)現(xiàn)有崩落的上皮組織塊、壞死的上皮細(xì)胞和大量的空白區(qū)域(圖2c-2)。性腺和心臟也被認(rèn)為是WSSV感染的主要器官，光鏡下攻毒螯蝦的性腺和心臟組織細(xì)胞核腫脹，核濃染并固縮，細(xì)胞致密變化，細(xì)胞排列雜亂無章，界限消失(圖2d，e-2)。而在對照健康螯蝦的兩種組織內(nèi)細(xì)胞排列有序，細(xì)胞界限分明，細(xì)胞器完整(圖2d，e-1)。對照組健康螯蝦的鰓組織細(xì)胞分布均勻，細(xì)胞器十分完整，細(xì)胞核很規(guī)則，染色質(zhì)分布均勻(圖2f-1)。而攻毒后瀕死螯蝦的鰓組織發(fā)生嚴(yán)重病變，核染色質(zhì)發(fā)生碎裂、邊緣化，核仁的形態(tài)很模糊，細(xì)胞的分布也不均勻(圖2f-2)。在光鏡下發(fā)現(xiàn)，健康螯蝦的血淋巴中含有大量的顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，分布均勻。而攻毒螯蝦的血淋巴中透明細(xì)胞和顆粒細(xì)胞消失，只有少量細(xì)胞碎屑，細(xì)胞核碎片化(圖3a，b)。透射電鏡下觀察從病蝦體內(nèi)抽取的血淋巴，發(fā)現(xiàn)有WSSV粒子存在于血淋巴里(圖3c)。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在攻毒螯蝦體內(nèi)，肝胰腺組織內(nèi)細(xì)胞器的大量損傷、壞死使細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)大片空洞，在肝胰腺細(xì)胞內(nèi)未發(fā)現(xiàn)病毒粒子，但周圍的結(jié)締組織內(nèi)卻發(fā)現(xiàn)大量病毒粒子(圖4a)，說明病毒粒子主要侵染結(jié)締組織。肌肉的結(jié)締組織內(nèi)出現(xiàn)少量的病毒粒子，大量結(jié)締組織空泡化(圖4b)。攻毒后螯蝦的中腸組織病變主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞大量萎縮，細(xì)胞核大量減少，細(xì)胞內(nèi)有大量的病毒粒子，并伴隨著細(xì)菌的大量滋生。說明螯蝦在受到病毒侵染后，自身機(jī)體的抵抗力下降，細(xì)菌乘機(jī)在腸道細(xì)胞內(nèi)繁殖(圖4c)。鰓組織被嚴(yán)重感染，大量的病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖，細(xì)胞膜內(nèi)外可見大量的黑色粒子，染色質(zhì)消失，細(xì)胞核膨脹，細(xì)胞質(zhì)崩潰(圖4d)。

討論

與對蝦感染白斑綜合征病毒不同的是，克氏原螯蝦感染后的死亡率為90%，而陽性檢出率卻是100%，說明有10%的螯蝦是存活的白斑綜合征病毒攜帶者?，F(xiàn)有的研究成果也表明，克氏原螯蝦是南美白對蝦白斑綜合征病毒的中間宿主和越冬宿主，也就是說池塘里的克氏原螯蝦能攜帶白斑綜合征病毒鉆洞過冬，并且在來年再傳染給南美白對蝦［8］。因此在實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)中，特別是發(fā)生過白斑綜合征病害的池塘，要充分利用冬閑處理的時(shí)機(jī)，徹底清除池塘里的克氏原螯蝦。有研究指出WSSV先感染宿主血細(xì)胞，再通過血液循環(huán)將病毒粒子傳播到宿主體內(nèi)的其它組織［9］。本研究也發(fā)現(xiàn)WSSV可以感染螯蝦的血細(xì)胞，并使血細(xì)胞大量減少，這與李鈁等［10］的研究結(jié)果相同。WSSV感染的細(xì)胞主要分布在外胚層和中胚層起源的組織，如表皮、鰓、肌肉、前腸、后腸、胃、性腺、淋巴組織、心臟、觸角腺以及神經(jīng)系統(tǒng)的相關(guān)細(xì)胞等［11-13］。由于甲殼動物特殊的攝食方式，感染W(wǎng)SSV病蝦的肌肉等組織很容易被其它甲殼動物攝食并在水中釋放出病毒粒子，病毒粒子可以經(jīng)鰓部感染宿主，而鰓也被公認(rèn)是WSSV感染較嚴(yán)重的部位。本研究也發(fā)現(xiàn)WSSV在鰓組織的細(xì)胞內(nèi)大量增殖，同時(shí)中腸的細(xì)胞內(nèi)也發(fā)現(xiàn)有WSSV的大量增殖，中腸是螯蝦腸道中與消化、吸收密切相關(guān)的部位，也被認(rèn)為是WSSV感染螯蝦的主要部位［14］。