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1材料與方法

1．1利用江蘇省農業(yè)科學院蔬菜研究所十字花科項目組不結球白菜研究材料T青做父本進行轉育，得到F1代。2011年春，將雙親及F1代種植于江蘇省農業(yè)科學院蔬菜研究所實驗田。對F1代植株進行自交，得到F2代，F(xiàn)1代單株與不結球白菜親本回交，得到BC1代。田間管理按常規(guī)方法進行。

1．2方法

1．2．1各世代植株抗性鑒定供試材料:T青、結球白菜抗源CR、F1、F2及BC1。每個材料3次重復，每次重復30株，隨機排列，播種于50孔穴盤。待苗長到3～4片真葉時移栽營養(yǎng)缽，采用灌根法進行抗性鑒定。用移液器吸取1ml含5×107或1×108個孢子懸浮液10ml，澆注到寄主根際周圍，接菌6周后，洗凈根部泥土，調查單株發(fā)病情況，并計算病情指數(shù)。田間病情分級參考前人研究分級標準［3］，略有改動。分級標準為:0級，未發(fā)生病害;1級，根系的須根、側根有較少細小腫瘤，主根未發(fā)生病害;2級，根系的須根腫瘤多，側根腫瘤較多，主根發(fā)病較輕，微微腫大;3級，根系的主根發(fā)病較重，異常腫大，大部分須根、側根腫瘤多;4級，根系的主根異常腫大，根系幾乎無須根。0級為抗病，其他均為感病。

1．2．2抗感池的構建及引物篩選采用BSA法，在F2群體中分別隨機選取10株抗病單株和10株感病單株，將其DNA等量混合，構建抗病基因池和感病基因池，對引物進行篩選，挑選在抗、感病池間能夠產生特異性條帶的引物。

1．2．3PCR反應體系及反應程序ISSR反應體系的總體積為20μl，包括1×PCRbuffer，模板DNA30ng，Taq酶1U、dNTP250.00μmol/L、引物0.25μmol/L、Mg2+2.5mmol/L。ISSR反應程序為94℃預變性5min;94℃變性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min30s，循環(huán)35次;72℃延伸10min，擴增產物4℃保存。

1．2．4瓊脂糖電泳分離反應結束后，PCR產物點入含0.5μg/mlEB的2.0%瓊脂糖凝膠中，以DNAmarkerV(Tiangen)作為分子量標準，在2．0%瓊脂糖凝膠中電泳1h，紫外凝膠成像儀下照相。

1．2．5ISSR標記的連鎖分析將篩選出的ISSR標記在雙親及F2分離群體中進行驗證，用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。親本為抗病有標記帶和感病無標記帶，F(xiàn)1代為感病有標記帶，F(xiàn)2代中重組型個體為抗病無標記帶、雜合感病無標記帶和純合感病有標記帶，根據(jù)F2代中重組型單株的數(shù)量計算交換率，再根據(jù)Kosambi作圖函數(shù)公式換算成Morgan遺傳距離。

2結果

2．1抗根腫病群體抗性鑒定親本、F1、F2和BC1群體對根腫病的抗性鑒定結果(表1)顯示，結球白菜抗源CR共接種20株，表現(xiàn)為高抗根腫病(抗性等級為0級)，T青共接種20株，表現(xiàn)為高感根腫病(抗性等級為3級以上)。F1共接種30株，表現(xiàn)為高抗根腫病(抗性等級為0級)。F2隨機選取73株，54株表現(xiàn)為高抗(抗性等級為0級)，其他感病(1株病級為1級，2株病級為2級，16株病級達3級)，抗感分離比為54∶19，滿足3∶1(χ2=0.074＜χ20．05=3.84)。BC1隨機選取70株，36株表現(xiàn)為高抗(抗性等級為0級)，34株感病(2株病級1級，1株病級2級，31株病級達3級)，抗感分離比為36∶34，滿足1∶1(χ2=0.057＜χ20．05=3.84)。分析各病級范圍內的單株頻數(shù)，未發(fā)現(xiàn)4級病害的單株。表明該根腫病的抗性受顯性單基因控制。

2．2分子標記的篩選用90條ISSR引物進行親本PCR擴增，其中21條ISSR引物可以在親本間穩(wěn)定擴增出清晰多態(tài)性條帶，占總引物數(shù)的23.0%。將能夠擴增到清晰多態(tài)性條帶的引物在抗感池中篩選，結果發(fā)現(xiàn)，引物873(5''''-GA-CAGACAGACAGACA-3'''')可以在抗感基因池中擴增出多態(tài)性條帶，差異片段分別約為500bp(圖1)。由于抗根腫病基因是顯性基因，如果標記與抗病基因緊密連鎖，純合抗病株和雜合抗病株都能擴增出此帶，而純合感病株應沒有此帶。利用F2分離群體中的73個單株DNA對候選引物進一步驗證，結果顯示，標記873在54份高抗根腫病單株(抗性0級)中，53個擴增出差異條帶，1個未擴增出差異條帶。同樣19份感病單株中，有6份擴增產生特異條帶。因此共有7株在標記873與抗病基因之間發(fā)生重組，交換率為9．59%。依據(jù)Kogambi圖函數(shù)公式得出標記873與抗根腫病基因之間的遺傳距離為9．72cM，命名為CR-873。

3討論

在B．rapa中發(fā)現(xiàn)了至少3個主要的根腫病抗性基因，這些基因是相對獨立的，且分別對不同的P．brassicae生理小種發(fā)生作用［12-14］。Diederichsen等利用ECD04和DH群體發(fā)現(xiàn)了B．napus根腫病抗性由1個主效基因和至少2個隱性基因控制［15］。王芳展等認為，B．rapa大多數(shù)抗性基因都來自于歐洲飼料蕪菁，不同的品種獲得了1個或者多個的抗性基因，而這些基因之間又相對保持獨立［16］。本研究通過對抗根腫病多世代群體進行抗性鑒定表明，不結球白菜抗性由顯性單基因控制。Matsumoto等發(fā)現(xiàn)了2個RFLP標記與1個CR基因CRa連鎖，并將其定位在R3染色體34cM的位置上［17］。Suwabe等利用SSR標記，發(fā)現(xiàn)了Crr1和Crr22個CR位點［18］。Kuginuki等利用Siloga作為抗源，發(fā)現(xiàn)了3個RAPD標記與CR位點連鎖［19］。ISSR技術可以比RFLP、SSR、RAPD等技術更多地揭示基因組中的多態(tài)性，并比RAPD穩(wěn)定，比AFLP簡便，是一種很好的DNA指紋標記。本研究采用BSA和ISSR技術相結合來研究與不結球白菜抗根腫病基因連鎖的標記，得到1個與根腫病抗性基因連鎖較緊密的分子標記CR-873，遺傳距離為9.72cM。本研究中得到的CR-873標記與抗根腫病基因的遺傳距離仍然較遠，可能是因為本研究中用于計算遺傳距離的群體偏小，一定程度上影響遺傳距離的準確性。后續(xù)研究可以進一步擴大群體并把獲得的可能與抗根腫病基因相連鎖的ISSR標記轉換為更穩(wěn)定的SCAR標記。

作者：張慧徐海況媛媛宋波陳龍正袁希漢單位：南京農業(yè)大學江蘇省農業(yè)科學院