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本文作者：陸勝民1尹穎12陳劍兵1夏其樂(lè)1張俊1作者單位：1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所2.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院

商品化的柑橘果膠(CP)是從萊姆、檸檬、葡萄柚、甜橙等柑橘果皮中所提取的一種復(fù)雜多聚糖的長(zhǎng)鏈碳水化合物，分子質(zhì)量一般在100ku以上。在食品工業(yè)中，柑橘果膠主要作為食品膠凝劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和乳化劑，用來(lái)制造果醬、果凍、果膠軟糖、果脯、蜜餞、乳制品、罐頭、果汁飲料等。研究表明，果膠具有降低血糖、血脂等作用，因此可用于生產(chǎn)防治糖尿病、肥胖癥、高血脂等疾病的保健食品[1]。

CP作為一種水溶性膳食纖維，具有抗癌活性[2]，但由于其分子質(zhì)量較大，食用后不易被腸道吸收，在人體內(nèi)很難發(fā)揮抗癌功效。CP經(jīng)過(guò)酸、堿、酶、高溫等處理可使得其長(zhǎng)鏈斷裂，得到分子質(zhì)量較低的低分子柑橘果膠(LMCP)。LMCP因其分子質(zhì)量和酯化度較低，無(wú)分支，易被腸道吸收，并可進(jìn)入血液循環(huán)進(jìn)一步發(fā)揮抗癌作用[3]。

目前國(guó)際上還沒(méi)有統(tǒng)一的LMCP產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)，主要通過(guò)pH修飾法對(duì)果膠多糖進(jìn)行水解而制得。其中堿水解主要是引起皂化，降低果膠糖鏈的酯化度；酸水解主要是引起多糖鏈中糖苷鍵的斷裂，使原本的多糖長(zhǎng)鏈降解為低分子質(zhì)量片斷[4-5]。不同濃度的酸、堿，不同的處理時(shí)間所得果膠在得率、分子質(zhì)量和酯化度上都會(huì)有所不同[6]。采用高溫處理CP制備LMCP的方法，具有操作簡(jiǎn)單易行，且無(wú)任何毒副作用的優(yōu)點(diǎn)。本文以高溫處理法制備LMCP，并測(cè)定其分子質(zhì)量、半乳糖醛酸含量、酯化度和體外抗人前列腺癌激素不依賴型PC3細(xì)胞活性，以期為進(jìn)一步開發(fā)LMCP抗癌輔助侯選藥物或功能性食品提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

柑橘果膠：浙江衢州果膠有限公司；半乳糖醛酸、葡聚糖分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品、噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)：美國(guó)Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶：Gibco公司；胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；其他試劑均為分析純。Waters515型凝膠色譜儀：美國(guó)Waters公司，TOSOHBIOSEPG4000SWXL柱，Waters2410示差折光檢測(cè)器；UV-1800紫外分光光度計(jì)：島津公司；Model3111型CO2培養(yǎng)箱：ThermoFisher公司；Model680型酶標(biāo)儀：BioRad公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1LMCP的制備

稱取CP30g，置于5L三角瓶中，加少量95%酒精濕潤(rùn)，然后加入3L沸水，攪拌溶解。待果膠溶解完全后，經(jīng)100目濾布過(guò)濾，濾液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至原液的1/3。濃縮后的果膠液經(jīng)121℃高溫處理30min，自然冷卻后于-20℃冰箱中冷凍2~3h，再于-78℃冰箱中冷凍3h，最后進(jìn)行冷凍干燥，樣品粉碎后即得到LMCP。

1.2.2半乳糖醛酸(GalA)含量的測(cè)定

采用間羥基聯(lián)苯法測(cè)定半乳糖醛酸含量[7]。取1.0mg/mL半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL置于10mL容量瓶中，加蒸餾水定容，再分別取上述定容的溶液各1.0mL置于20mL具塞試管中，置于冰水浴中，加入四硼酸鈉-硫酸溶液5.0mL，用旋渦混合器混勻，于沸水浴中加熱5min，冰水浴中冷卻后用微量加樣槍加入1.5mg/mL間羥基聯(lián)苯溶液100μL，混勻后振搖5min，超聲除去氣泡。以1mL蒸餾水同上操作制得空白液調(diào)零，在524nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)糖醛酸質(zhì)量濃度ρ(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，分別稱取待測(cè)定樣品0.05g，置于50mL容量瓶中，定容，再分別量取0.5mL溶液，置于10mL容量瓶中定容，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的方法進(jìn)行樣品含量的測(cè)定，計(jì)算公式：（略）。

1.2.3酯化度(DE)測(cè)定

采用化學(xué)滴定法測(cè)果膠酯化度[8]。稱取5g果膠樣品到250mL錐形瓶中，加入5mL的濃鹽酸和100mL60%的乙醇，振搖10min。真空抽濾，每次用15mL的濃鹽酸和60%乙醇混合液(1:20，v/v)洗滌6次，再用60%的乙醇洗滌直至沒(méi)有明顯不溶物溶出為止。然后用20mL無(wú)水乙醇洗滌后，在60℃干燥2h，冷卻，稱重。稱取500mg干燥后的樣品到250mL錐形瓶中，加入2mL乙醇和100mL不含二氧化碳的沸水。蓋上蓋子振搖直至果膠完全溶解或已經(jīng)水解為止。加入5滴酚酞指示劑，用0.1mol/L的NaOH溶液標(biāo)定，記錄標(biāo)定體積V1。加入20mL0.5mol/L的NaOH溶液，塞緊，劇烈振搖15min。加入20mL0.5mol/L的HCl溶液，搖晃直至粉紅色消失，加入3滴酚酞指示劑，用0.5mol/L的NaOH溶液標(biāo)定至淡粉紅色，記錄標(biāo)定體積V2。酯化度為：E=V2/(V1+V2)。

1.2.4分子質(zhì)量的測(cè)定

采用高效凝膠色譜法測(cè)定分子質(zhì)量[9]，Waters515型凝膠色譜儀選用TOSOHBIOSEPG4000SWXL型色譜柱和Waters2410示差折光檢測(cè)器。流動(dòng)相為0.2mol/L硝酸鈉溶液，流速為0.5mL/min，柱溫40℃，進(jìn)樣濃度為50μg/μL，進(jìn)樣體積為50μL。

1.2.5抗前列腺癌細(xì)胞活性的測(cè)定

人前列腺癌PC3細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞活性抑制檢測(cè)方法為MTT法[10-12]。用含10%胎牛血清、100U/L青霉素和100mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2并飽和濕度的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為4×104/mL，每孔100μL細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種24h后給藥(100μL/孔)，分別設(shè)空白對(duì)照組、細(xì)胞對(duì)照組以及5個(gè)濃度受試藥物組。繼續(xù)培養(yǎng)72h后每孔加入100μLMTT(1mg/mL，以DMEM培養(yǎng)液溶解)，37℃培養(yǎng)4h，棄去各孔內(nèi)液體后加入150μL酸化異丙醇(含0.04mol/L鹽酸)，避光放置30min，酶標(biāo)儀測(cè)定570nm處吸光度，計(jì)算受試藥物對(duì)PC3細(xì)胞的增殖抑制率，并以孫瑞元[13]教授編寫的NDST(NewDrugStatisticalTreatment)計(jì)算機(jī)程序計(jì)算受試物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖(72h)的半數(shù)抑制濃度(IC50)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率公式如下：（略）。

2結(jié)果與分析

2.1LMCP特性分析

2.1.1半乳糖醛酸含量

果膠分子主鏈為帶負(fù)電荷的半乳糖醛酸鏈，半乳糖醛酸的含量影響果膠的電荷、酸堿性、成膠性及鈣離子結(jié)合等物理性質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)采用的是間羥基聯(lián)苯法測(cè)定半乳糖醛酸含量，此方法穩(wěn)定性好，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較好，而傳統(tǒng)的“硫酸-咔唑法”容易受到中性己糖和戊糖的干擾。半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。圖2顯示，天然CP的半乳糖醛酸含量的平均值為64%，經(jīng)過(guò)高溫處理后，LMCP半乳糖醛酸含量的平均值為78%，上升了21.88%。這可能是因?yàn)榻?jīng)過(guò)高溫處理后，果膠酯化度降低，原本以酯化形式存在的半乳糖醛酸羧基變成了游離的羧基，使得半乳糖醛酸的含量上升。

2.2.2酯化度含量

酯化度決定著果膠的溶解度、凝膠能力和凝膠條件以及在特定pH下的穩(wěn)定性。從圖2可知，原料CP酯化度為59%，LMCP的酯化度為38%，下降35.6%。Jackson等[14]通過(guò)對(duì)商品名為PectaSol的市售改性柑橘果膠(MCP)的研究發(fā)現(xiàn)，PectaSol不具備前列腺癌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用，可能是經(jīng)過(guò)堿處理后同型半乳糖醛酸聚糖(HG)含量過(guò)高或酯化度過(guò)低所致。因此，低分子柑橘果膠酯化度并非越低越好，適度降低酯化度可增大溶解性，酯化度的降低也會(huì)改變果膠的一些理化性質(zhì)，但是LMCP作為抗癌藥物的備選物，其酯化度降低的利弊以及降低多少適宜還需要進(jìn)一步的研究。

2.2.3分子質(zhì)量測(cè)定

以不同分子質(zhì)量的葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并在相同條件下分別對(duì)高溫處理前后的樣品進(jìn)行分析，得到果膠熱處理前后的分子質(zhì)量分布如圖3、表1所示?？芍?jīng)高溫處理后果膠分子質(zhì)量明顯降低，其Mn、Mw和Mp均低于10ku。

2.3藥理活性

未經(jīng)高溫處理的CP抗前列腺癌細(xì)胞活性見表2，經(jīng)過(guò)高溫處理后制得的LMCP抗前列腺癌細(xì)胞活性見表3。由表2可知未經(jīng)高溫處理的CP本身就具有一定的抑制癌細(xì)胞增殖的能力，且高劑量下(5~10mg/mL)抑制率達(dá)40%以上，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖(72h)的半數(shù)抑制濃度(IC50)為(6.68±0.05)mg/mL。從表3可知，經(jīng)過(guò)高溫處理后制得的LMCP對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖(72h)的半數(shù)抑制濃度(IC50)為(3.55±0.44)mg/mL，相對(duì)于CP，其IC50降低了48.86%。雖然天然的CP具備一定的抑制癌細(xì)胞增殖的能力，然而，高劑量的CP不易被人體細(xì)胞吸收，實(shí)際進(jìn)入體內(nèi)作用于癌細(xì)胞的可能性較小。比較表2和表3可知，中劑量(2.5mg/mL)下兩者抑制率很接近，但高劑量(5、10mg/mL)下LMCP對(duì)PC3的抑制率遠(yuǎn)大于CP，且半數(shù)抑制濃度(IC50)明顯低于CP，即表明經(jīng)過(guò)高溫處理后，抗前列腺癌細(xì)胞活性的能力顯著增強(qiáng)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低劑量(0.625、1.25mg/mL)下LMCP對(duì)癌細(xì)胞增殖的抑制率為負(fù)值，由此推斷LMCP具有一定的營(yíng)養(yǎng)作用，對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒害作用。相關(guān)研究報(bào)道表明低分子果膠抗癌主要是通過(guò)抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、侵襲和血管生成等多種活性[15]，并且具有一定的選擇性。張文博等[16]研究了MCP對(duì)肝癌U22細(xì)胞、宮頸癌U14細(xì)胞和肉瘤S180細(xì)胞的抗性，發(fā)現(xiàn)MCP對(duì)前兩種癌細(xì)胞有抗性，但對(duì)肉瘤S180細(xì)胞沒(méi)有抑制活性。

3結(jié)論

以天然柑橘果膠為原料，通過(guò)121℃處理30min可將果膠分子質(zhì)量降到10000u以下，半乳糖醛酸含量為78%，酯化度為38%的低分子柑橘果膠。細(xì)胞試驗(yàn)表明制得的低分子柑橘果膠的對(duì)PC3細(xì)胞有很強(qiáng)的抑制作用，中劑量(2.5mg/mL)下抑制率可達(dá)38%，高劑量(5~10mg/mL)下抑制率達(dá)80%~90%，腫瘤細(xì)胞增殖(72h)的半數(shù)抑制濃度為(3.55±0.44)mg/mL，相對(duì)于天然的柑橘果膠，其抗前列腺癌細(xì)胞活性顯著增強(qiáng)。