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作者：曹偵馮廣朋莊平王慧王瑞芳章龍珍單位：中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

1材料與方法

1.1材料來(lái)源與血清采集實(shí)驗(yàn)用蟹來(lái)源于2010年12月長(zhǎng)江口(上海寶楊碼頭)增殖放流的中華絨螯蟹親蟹。放流親蟹為人工繁育與養(yǎng)殖的中華絨螯蟹,共3萬(wàn)只,雌雄比例為3∶1,生長(zhǎng)環(huán)境為露天土池塘,水草覆蓋率在50%以上。其中5000只標(biāo)志,標(biāo)志方法為在親蟹右邊螯足上套上專用套環(huán)并在其甲殼背面下方貼上防偽標(biāo)簽。放流親蟹通過(guò)絲網(wǎng)回捕,網(wǎng)目大小為10cm,網(wǎng)高1.5m。每天回捕放流親蟹的時(shí)間根據(jù)當(dāng)天落潮的時(shí)間而定,落潮將要結(jié)束的時(shí)候拉起網(wǎng)具。每次拉網(wǎng)的時(shí)候記錄親蟹總數(shù)、標(biāo)志蟹數(shù)量和水文(水溫、鹽度、pH等)等數(shù)據(jù)。對(duì)每次回捕到的標(biāo)志親蟹均詳細(xì)記錄形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)(體重、殼長(zhǎng)、殼寬等)并取樣,當(dāng)每次回捕親蟹的數(shù)量小于20只時(shí)全部取樣,如多于20只則隨機(jī)取20只親蟹樣本。將親蟹用冰麻醉15—20min后,取出擦干體表水分,快速測(cè)量其體質(zhì)量、殼長(zhǎng)和殼寬。然后用一次性注射器于蟹第三步足基部血竇處抽取血淋巴2mL,在4℃、3000r/min的條件下離心20min,取上層血清存于Eppendorf離心管中,存放于?20℃冰箱中,用于各項(xiàng)血液指標(biāo)的測(cè)定。然后在裝滿碎冰的冰盤(pán)上快速解剖親蟹,取其肝胰腺存于Eppendorf離心管中,保存于?80℃冰箱中備用。為盡量減少長(zhǎng)江口復(fù)雜環(huán)境因素變化對(duì)放流親蟹生理生化等指標(biāo)的干擾,實(shí)驗(yàn)選取回捕位置相對(duì)比較集中(31°12.776′N—31°10.570′N,121°49.200′E—121°50.800′E)、回捕數(shù)量較多的同一區(qū)域不同時(shí)間內(nèi)回捕到的標(biāo)志蟹的樣品進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定,共77只(表1),按回捕日期距放流時(shí)間(d)分組,將放流前的中華絨螯蟹組記為0d。各組蟹的回捕位置、樣本量、規(guī)格及水文情況(表1)。

1.2測(cè)定指標(biāo)及其測(cè)定方法用深圳邁瑞MINDRAYBS-200全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、堿性磷酸酶(ALP)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、肌酐(CREA)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)的活性或含量。先將欲測(cè)的指標(biāo)定標(biāo)校準(zhǔn),然后按照生化分析儀操作說(shuō)明和配套試劑盒測(cè)試流程進(jìn)行測(cè)定,其中TP、ALB、TC、TG采用終點(diǎn)法,ALP、ALT、AST采用動(dòng)力學(xué)法,CREA采用固定時(shí)間法。血清中血藍(lán)蛋白含量的測(cè)定參照Chen,etal.[14],通過(guò)UNICOUV-2802S紫外分光光度計(jì)測(cè)得,血藍(lán)蛋白含量(mmol/L)=(A×R)/(ε×S×P),式中:A為分光光度計(jì)測(cè)得的吸光度值;R為反應(yīng)液的總體積(μL);ε為消光系數(shù);S為待測(cè)樣品的體積(μL);P為分光光度計(jì)中光穿透長(zhǎng)度(cm)。肝胰腺中超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)的活性采用采用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定,嚴(yán)格按照對(duì)應(yīng)試劑盒中的操作流程進(jìn)行測(cè)定。

1.3統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SE)表示,采用SPSS18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,處理時(shí)對(duì)各指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),若具有方差齊性,則按照單因素方差分析(ANOVA),LSD檢驗(yàn)法進(jìn)行組間數(shù)值多重比較;若不具有方差齊性,則按照單因素方差分析(ANOVA),Dunnett’sT3檢驗(yàn)法進(jìn)行組間均值多重比較。P<0.05表示差異顯著,P>0.05表示差異不顯著。

2結(jié)果

2.1抗氧化酶、磷酸酶和轉(zhuǎn)氨酶的變化中華絨螯蟹親蟹肝胰腺中SOD和CAT的活性在放流后均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì),且均在放流后9d活性最低,其中,肝胰腺中SOD的活性在放流后9d較放流前顯著降低(P<0.05)(表2)。放流后70d及79d肝胰腺SOD的活性較放流前顯著升高(P<0.05),而CAT活性放流前后變化不顯著(P>0.05)。放流親蟹肝胰腺中ACP的活性在放流后出現(xiàn)升高的趨勢(shì),到6dACP活性較高,但與放流前相比差異不顯著(P>0.05),而后開(kāi)始降低(表2)。在放流后13d降到最低并顯著低于放流前(P<0.05),而后又開(kāi)始升高,在22d達(dá)到放流前水平。放流后70d到79d有下降趨勢(shì),但均與放流前差異不顯著(P>0.05)。在親蟹血清中ALT、AST和ALP的活性在放流后的變化趨勢(shì)總體一致,在放流后9d均達(dá)到最高值且顯著高于放流前(P<0.05),而后開(kāi)始下降(表3)。放流后79d,血清中三者活性基本恢復(fù)至放流前水平(P>0.05)。

2.2蛋白質(zhì)、脂類和肌酐的變化在親蟹血清中TP的含量呈先升高后降低趨勢(shì),在6d達(dá)到最大值,而后下降,22d以后TP含量顯著低于放流前(P<0.05)(表4)。在血清中ALB的含量在放流后總體呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì),放流后13d左右其含量最高,且與放流前差異顯著(P<0.05),而后下降,放流后70d左右血清中ALB的含量較放流前顯著降低(P<0.05)。血藍(lán)蛋白的含量呈波動(dòng)性變化,放流后血藍(lán)蛋白出現(xiàn)明顯下降(P<0.05),9d恢復(fù)至放流前水平,13d后血清血藍(lán)蛋白含量趨于穩(wěn)定并顯著低于放流前含量(P<0.05)。在放流中華絨螯蟹血清中TC的含量大體上也呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì),放流后6dTC含量顯著升高(P<0.05),9d開(kāi)始下降,70d以后雄蟹血清中的TC含量較放流前顯著降低(P<0.05)(表4)。在血清中TG的含量在放流后開(kāi)始下降,放流后9d左右TG含量最低且較0d差異顯著(P<0.05),13d和22d基本恢復(fù)至0d的水平(P>0.05),到70d左右最終趨于穩(wěn)定,但放流前顯著降低(P<0.05)。在親蟹血清中CREA含量在放流后呈現(xiàn)波動(dòng)變化,放流后13d其含量較放流前顯著升高(P<0.05),在70d和79d親蟹血清中CREA含量均較放流前差異不顯著(P>0.05)(表4)。

3討論

3.1中華絨螯蟹親蟹放流后抗氧化能力變化SOD和CAT是生物體內(nèi)的兩種抗氧化的主要酶類,它們可以相互配合清除生物體內(nèi)的活性氧自由基。SOD可以阻止氧自由基對(duì)細(xì)胞的損害、修復(fù)受損細(xì)胞并能通過(guò)反應(yīng)將氧自由基轉(zhuǎn)化成過(guò)氧化氫,而CAT可以將同樣對(duì)機(jī)體有害的過(guò)氧化氫分解成對(duì)生物體無(wú)害的水和氧。因此SOD和CAT常被用作判斷生物體非特異性免疫的能力的指標(biāo)[15—17]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在中華絨螯蟹親蟹肝胰腺中SOD和CAT活性在放流后的9d內(nèi)持續(xù)降低,13d后出現(xiàn)升高趨勢(shì),并在22d恢復(fù)至放流前水平,這可能說(shuō)明中華絨螯蟹親蟹的非特異性免疫能力在放流后降低,在22d左右恢復(fù)至放流前水平。放流后70d和79d親蟹的SOD和CAT的活性表明放流親蟹的非特異性免疫能力較放流前恢復(fù)并加強(qiáng)。從捕獲放流親蟹位置的水文信息可以得出,親蟹SOD和CAT的這種變化應(yīng)該跟環(huán)境,脅迫有主要關(guān)系。環(huán)境脅迫能夠促使生物體機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的線粒體、微粒體以及胞漿的酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)反應(yīng),產(chǎn)生活性氧和氧自由基,從而打破生物機(jī)體內(nèi)的活性氧代謝平衡,使生物體面臨活性氧傷害[18]。洪美玲等[19]研究發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹受溫度脅迫1d后血淋巴中SOD和CAT活力出現(xiàn)不同程度下降;陳宇鋒等[20]研究發(fā)現(xiàn)青蟹肝胰腺中SOD活動(dòng)隨鹽度脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)先降后升趨勢(shì);還有研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體新陳代謝速度加快會(huì)使機(jī)體自身抗氧化系統(tǒng)受到影響,從而產(chǎn)生大量的活性氧[11]。在實(shí)驗(yàn)中中華絨螯蟹親蟹肝胰腺SOD和CAT活性在放流后出現(xiàn)降低趨勢(shì),應(yīng)該是親蟹在向咸淡水交匯處洄游過(guò)程中受到溫度[21,22]、鹽度等環(huán)境因子的脅迫和蟹體通過(guò)加快自身新陳代謝來(lái)減少應(yīng)激共同作用的結(jié)果。中華絨螯蟹親蟹在放流9d后肝胰腺中SOD活性最低,這與陳宇鋒等[20]發(fā)現(xiàn)的青蟹經(jīng)鹽度應(yīng)激3d后肝胰腺中SOD活性最低的結(jié)果相似。

3.2中華絨螯蟹親蟹放流后血清磷酸酶、氨基轉(zhuǎn)移酶的變化ALP和ACP是甲殼動(dòng)物體內(nèi)兩種重要的磷酸酶,它們?cè)跈C(jī)體內(nèi)能夠直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝,加速機(jī)體內(nèi)物質(zhì)的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn),并能形成水解酶體系,破壞和消除入侵機(jī)體的異物,因此對(duì)維持蝦、蟹類的生存和生長(zhǎng)具有重要的意義[23—26]。研究發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹親蟹血清ALP和肝胰腺ACP活性在放流后出現(xiàn)升高,13d后開(kāi)始下降,其中ACP活性在22d基本恢復(fù)至放流前水平,而ALP活性在79d恢復(fù)至放流前水平。這可能是由于蟹進(jìn)入新環(huán)境后,必須通過(guò)加速物質(zhì)的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)提高自身的代謝速度,減緩環(huán)境對(duì)自身的應(yīng)激,而隨著蟹對(duì)新環(huán)境的適應(yīng),蟹血清中ALP和肝胰腺中ACP活性也慢慢下降。在放流后13d,蟹肝胰腺中的ACP較放流前顯著降低,推測(cè)這與ACP是巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶有關(guān)[24],ACP活性較放流前降低反映此時(shí)親蟹免疫力有所下降,這跟SOD和CAT活性變化反映出來(lái)的機(jī)體的抗氧化能力、免疫力下降的結(jié)果一致。研究表明中華絨螯蟹放流親蟹在放流后體內(nèi)磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝增強(qiáng),破壞和清除入侵異物的能力升高,而基本恢復(fù)至放流前水平可能需要22d左右,其中親蟹血清ALP活性要比肝胰腺中ACP活性恢復(fù)得慢。ALT和AST是兩種重要的氨基轉(zhuǎn)移酶,主要存在于肝臟和心肌細(xì)胞中,在血清中濃度較低。當(dāng)機(jī)體肝細(xì)胞或某些組織受損害時(shí),血清中的這兩種酶的活性就會(huì)升高[27,28]。研究發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹親蟹在放流后血清中ALT和AST活性升高,9d后兩者的活性最高,放流22d后ALT活性恢復(fù)至放流前水平,而AST活性在79d恢復(fù)至放流前水平。初步推測(cè)這可能是親蟹由于受到環(huán)境應(yīng)激導(dǎo)致組織受損,而隨著親蟹不斷對(duì)環(huán)境的適應(yīng),自身受損的組織逐步恢復(fù)。本研究表明中華絨螯蟹親蟹在放流后蟹體肝細(xì)胞或其他組織受損,在放流后9d可能受損最嚴(yán)重,22d左右親蟹肝細(xì)胞或其他組織逐漸恢復(fù)健康狀況,蟹體血清中ALT的恢復(fù)速度比AST快。

3.3中華絨螯蟹親蟹放流后血清蛋白的變化血藍(lán)蛋白是生物體內(nèi)的一種多功能蛋白,不僅具有輸氧、儲(chǔ)存能量、滲透壓調(diào)節(jié)、蛻皮過(guò)程調(diào)節(jié)、能量?jī)?chǔ)存、金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)等功能[29,30],而且血藍(lán)蛋白還具有酚氧化酶活性,具有抗菌功能[31,32]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹血清中血藍(lán)蛋白含量在放流后降低,9d后有所升高,13d降低并逐漸趨于穩(wěn)定。有研究表明,在較高鹽度的環(huán)境中血藍(lán)蛋白可以裂解為自由氨基酸來(lái)維持血淋巴滲透壓平衡[30],在實(shí)驗(yàn)中中華絨螯蟹親蟹在放流后血藍(lán)蛋白含量降低應(yīng)該是親蟹逐漸往咸淡水處洄游的結(jié)果。在10℃條件下,中華絨螯蟹親蟹進(jìn)入咸水2—3d后便進(jìn)入發(fā)情階段[33],血藍(lán)蛋白含量的升高可以滿足蟹體活動(dòng)和交配時(shí)對(duì)耗氧量的需要[34],親蟹在放流后9d血藍(lán)蛋白含量升高,應(yīng)該跟親蟹發(fā)情有關(guān)。ALB具有調(diào)節(jié)血漿膠體滲透壓以及運(yùn)輸?shù)裙δ?。?shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹親蟹血清ALB含量在放流后出現(xiàn)升高,13d含量最高而后開(kāi)始下降。初步認(rèn)為中華絨螯蟹親蟹血清ALB含量在放流后升高是親蟹通過(guò)自身調(diào)節(jié)來(lái)減少應(yīng)激反應(yīng)的結(jié)果,一方面蟹體調(diào)節(jié)自身血漿膠體滲透壓,另一方面蟹體通過(guò)加速物質(zhì)的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)提高自身的代謝速度導(dǎo)致的。而放流70d后ALB含量顯著低于放流前水平,具體原因還有待進(jìn)一步探討。血清TP不僅是一種重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),還具有運(yùn)輸、凝血、免疫以及調(diào)節(jié)血漿膠體滲透壓等作用[35],對(duì)蟹類的健康、營(yíng)養(yǎng)、疾病的判斷具有重要意義。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹親蟹血清TP含量升高,而后逐漸下降并在22d后顯著低于放流前水平。王順昌等[34]研究表明,中華絨螯蟹血清中TP含量受鹽度刺激影響較大,在蟹體剛?cè)胂趟畷r(shí)有上升趨勢(shì)。在本實(shí)驗(yàn)中親蟹在放流后TP含量升高,推測(cè)可能是親蟹往咸淡水洄游過(guò)程中受鹽度刺激的結(jié)果。親蟹血清TP含量在放流后13d下降并顯著低于放流前水平,可能是TP大量分解為自由氨基酸參與滲透壓調(diào)節(jié)的結(jié)果,也可能是受到血清中血藍(lán)蛋白和ALB含量降低的影響所致。

3.4中華絨螯蟹親蟹放流后血清肌酐與脂類的變化CREA是酸性肌酸的降解產(chǎn)物,在機(jī)體生理狀態(tài)正常時(shí)一般含量相對(duì)恒定,其含量的升高常被作為排泄器官受損和排泄功能受到破壞的判斷依據(jù)[36,37]。在甲殼動(dòng)物中,主要的排泄器官為觸角腺和鰓[37]。本研究發(fā)現(xiàn)親蟹血清CREA含量在放流后6d升高,22d降低,到70d左右基本恢復(fù)至放流前水平,表明中華絨螯蟹親蟹放流后觸角腺或鰓可能受損,親蟹的排泄功能受阻,22d后親蟹受損器官和排泄功能逐步恢復(fù)至正常。血清中TC和TG含量能夠反映機(jī)體脂類代謝的變化。脂類是中華絨螯蟹標(biāo)準(zhǔn)狀況下最主要的能源物質(zhì)[38],脂類物質(zhì)含量的變化常被作為甲殼動(dòng)物受到脅迫時(shí)的一種效應(yīng)[39]。例如,對(duì)蝦在受到脅迫時(shí)主要通過(guò)脂肪代謝來(lái)滿足自身的能量需求[40,41]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹親蟹血清TG含量在放流后呈現(xiàn)先降后升再降的波動(dòng)變化,TC含量則呈先升后降的變化。分析認(rèn)為親蟹血清中TG含量在放流后下降,可能是由于親蟹放流后通過(guò)脂肪分解獲取所需的能量來(lái)應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫(主要是鹽度和溫度)的結(jié)果。有研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)機(jī)體通過(guò)脂類提供所需能量時(shí),脂酶活性和機(jī)體內(nèi)游離脂肪酸含量升高,血液中TC含量降低[42,43]。在本實(shí)驗(yàn)中親蟹在放流后通過(guò)分解脂肪獲取能量時(shí),血清TC含量卻出現(xiàn)升高,具體原因還有待進(jìn)一步研究。由于長(zhǎng)江口環(huán)境的復(fù)雜性,本實(shí)驗(yàn)選取回捕位置較集中的放流親蟹為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,而且受到回捕親蟹樣本量的限制,所得結(jié)果僅能初步反映長(zhǎng)江口中華絨螯蟹放流親蟹對(duì)環(huán)境的生理適應(yīng)狀況,而較大范圍全面的生理適應(yīng)性還需要進(jìn)行系統(tǒng)試驗(yàn)進(jìn)一步闡明。

4結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn),中華絨螯蟹親蟹在放流后向長(zhǎng)江口咸淡水處洄游,蟹體出現(xiàn)非特異性免疫下降、代謝增強(qiáng)等反應(yīng),在放流后9d親蟹免疫力最低、物質(zhì)代謝均受到影響,放流后22d親蟹的各項(xiàng)機(jī)能逐步恢復(fù),并均在70d接近或達(dá)到放流前水平,表明此時(shí)放流親蟹基本適應(yīng)了長(zhǎng)江口的環(huán)境,同時(shí)也表明放流親蟹對(duì)長(zhǎng)江口環(huán)境的生理適應(yīng)可能需要22d,這可為今后長(zhǎng)江口中華絨螯蟹親蟹放流與生理適應(yīng)評(píng)估提供理論參考。為提高增殖放流效果,建議在放流前對(duì)親蟹進(jìn)行適宜的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化及環(huán)境適應(yīng)性馴化。