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1尋找差異表達(dá)的蛋白質(zhì)

在疾病基因組的研究中,為了尋找差異表達(dá)的疾病相關(guān)基因或蛋白質(zhì),除了采用傳統(tǒng)的分子生物學(xué)方法,如差減雜交[1]、抑制性差減雜交[2]、差異顯示PCR法[3]及基因表達(dá)串聯(lián)分析技術(shù)(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)[4]外,還可采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法,即從蛋白質(zhì)入手尋找新的或疾病相關(guān)基因或蛋白質(zhì)。基因和蛋白質(zhì)間并沒(méi)有一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系,有mRNA,不一定能表達(dá)為有功能的蛋白質(zhì)。但是,基因要表現(xiàn)其功能,一定要通過(guò)相應(yīng)的蛋白質(zhì)。所以,研究基因,特別是疾病相關(guān)基因,可從研究其表達(dá)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能入手。常見的幾種研究差異表達(dá)蛋白的蛋白質(zhì)組學(xué)方法包括蛋白芯片技術(shù)、雙向電泳技術(shù)、多維液相色譜技術(shù)以及它們和質(zhì)譜鑒定的有機(jī)結(jié)合。

1•1蛋白質(zhì)芯片技術(shù)

繼基因芯片以后,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)逐漸發(fā)展起來(lái)。基因芯片又叫DNA芯片,是以DN段為材料的,而蛋白質(zhì)芯片以蛋白質(zhì)或多肽為材料。利用蛋白芯片技術(shù)能同時(shí)從微量的樣品中檢測(cè)成千上萬(wàn)個(gè)蛋白質(zhì)或多肽,用于分析差異表達(dá)的蛋白質(zhì)及藥物靶標(biāo)的鑒定,所以,蛋白質(zhì)芯片在藥物基因組學(xué)的研究中發(fā)揮著極為重要的作用。眾所周知,蛋白質(zhì)不如核酸穩(wěn)定,在蛋白質(zhì)樣品的處理中將會(huì)遇到很多困難,對(duì)蛋白質(zhì)芯片的操作將比對(duì)基因芯片的操作要求更為嚴(yán)格。從基因組測(cè)序知道,僅有約30000~35000個(gè)基因維持人體正常的生理作用[5],由于RNA編輯及翻譯后修飾等因素,使得人體細(xì)胞的總蛋白質(zhì)數(shù)目(蛋白質(zhì)組)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)有活性的基因數(shù)目。因此,能同時(shí)檢測(cè)成千上萬(wàn)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)芯片技術(shù),是唯一可用來(lái)有效研究人體蛋白質(zhì)組的方法。目前,主要將蛋白芯片和表面增強(qiáng)的激光解吸離子化質(zhì)譜技術(shù)(SELDI-MS)相結(jié)合尋找差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。其原理是將不同生理狀態(tài)的樣品(培養(yǎng)的細(xì)胞或組織樣品)和同一蛋白芯片結(jié)合,洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì),然后用SELDI-MS分析結(jié)合的蛋白質(zhì)。一般來(lái)說(shuō),每種芯片可特異地結(jié)合某一細(xì)胞特定的蛋白質(zhì)。具體的操作方法隨不同廠家生產(chǎn)的蛋白芯片不同而異。LiX及其同事[6]將小鼠MRL的耳朵穿刺,觀察耳朵上傷口愈合過(guò)程中蛋白質(zhì)表達(dá)的變化情況,用蛋白芯片分析的結(jié)果表明,分子量為23•56ku的蛋白在傷口愈合過(guò)程中表達(dá)量大幅度增加,加速了傷口的愈合。盡管蛋白質(zhì)芯片技術(shù)正逐漸得到廣泛應(yīng)用,但在應(yīng)用于尋找差異表達(dá)蛋白時(shí)也有局限性:1)待檢的低豐度蛋白往往被高豐度蛋白所掩蓋而不能檢測(cè)出來(lái),2)蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)對(duì)檢測(cè)小分子量的蛋白有效,檢測(cè)范圍為10~30ku,但是10~30ku的蛋白只是占總蛋白的一小部分。

1•2多維分離技術(shù)

對(duì)于復(fù)雜的蛋白質(zhì)樣品,比如特定組織或細(xì)胞中的所有蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)組),僅靠某一分離原理將它們分開是不可能的,而要利用蛋白質(zhì)的不同性質(zhì)將它們分離開,由此而發(fā)展起來(lái)的分離技術(shù)叫多維分離技術(shù)(multidimensionalseparation)。目前主要采用的是二維分離技術(shù),因?yàn)閷?duì)于大多數(shù)蛋白質(zhì)的分離,采用蛋白質(zhì)間某兩個(gè)性質(zhì)的不同,利用二維分離技術(shù)已足夠了。其中,雙向電泳技術(shù)和二維液相色譜以及它們和質(zhì)譜的聯(lián)用,已成為當(dāng)今蛋白質(zhì)組學(xué)研究的有力工具。

1•2•1雙向電泳技術(shù):雙向電泳(two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE)技術(shù)是80年展起來(lái)的一種有效的二維分離技術(shù)。其原理是基于不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量不同的特性,第一相是等電聚焦電泳,第二相是SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。很多實(shí)驗(yàn)室利用不同的雙向電泳技術(shù)建立了特定組織或細(xì)胞的雙向電泳數(shù)據(jù)庫(kù)(2DPAGE),以供不同的實(shí)驗(yàn)室檢索和比較雙向電泳圖譜。SWISS-2DPAGE是一個(gè)經(jīng)注釋過(guò)的雙向電泳公共檢索數(shù)據(jù)庫(kù),其格式和SWISS-PROT蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)類似。在SWISS-2DPAGE數(shù)據(jù)庫(kù)中包括蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜(其中標(biāo)明了蛋白質(zhì)的具體位置)、建立圖譜的具體方法和程序、以及相關(guān)的病理和生理數(shù)據(jù)。關(guān)于蛋白質(zhì)的雙向電泳數(shù)據(jù)可通過(guò)如下服務(wù)器進(jìn)行檢索:expasy•hcuge•ch/。在功能基因組時(shí)代,雙向電泳技術(shù)除了用于分離復(fù)雜的蛋白樣品,建立雙向電泳數(shù)據(jù)庫(kù)外,主要用于尋找不同組織或細(xì)胞中差異表達(dá)的蛋白質(zhì),以進(jìn)行疾病相關(guān)蛋白或基因的研究。先用pH3-10的IPG膠條,對(duì)疾病組織和正常組織進(jìn)行雙向電泳分離,然后利用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)所產(chǎn)生的2-DE圖譜進(jìn)行分析,找出差異表達(dá)的蛋白。

如果想得到更為詳細(xì)的2-DE圖譜,可用pH4-7或pH6-9的膠條,甚至只有一個(gè)pH單位的窄pH范圍的膠條,從而使分辨率大大提高。將找到的差異表達(dá)蛋白斑點(diǎn)從膠上切下來(lái),經(jīng)酶消化(常用胰蛋白酶),通過(guò)質(zhì)譜(MS)或串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)測(cè)定和數(shù)據(jù)庫(kù)搜索,鑒定出所差異表達(dá)蛋白。然而,雙向電泳技術(shù)有許多局限性,由于樣品處理的差別、翻譯后修飾、人為修飾等導(dǎo)致同一基因表達(dá)的蛋白質(zhì)遷移到不同的位置;另外,不同的蛋白也會(huì)遷移到同一斑點(diǎn),出現(xiàn)共遷移現(xiàn)象,從而使得用2-DE進(jìn)行定性和定量分析變得相當(dāng)復(fù)雜。而且,對(duì)于低豐度和低拷貝數(shù)蛋白的檢測(cè)也相當(dāng)困難。雙向電泳要求操作者熟練掌握電泳、染色及軟件分析技術(shù),整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要穿實(shí)驗(yàn)服,戴手套,盡量避免角蛋白等污染,才能得到較好的重復(fù)性。為了改進(jìn)雙向電泳的重復(fù)性和靈敏度,最近發(fā)展了一種熒光染料標(biāo)記的雙向電泳技術(shù)即凝膠內(nèi)差別電泳(differentialin-gelelec-trophoresis,DIGE)[7]。將樣品和對(duì)照品分別用1-(5-羧戊基)-1′-丙基靛碳氰鹵化物(Cy3)N-羥基琥珀酸酯[1-(5-carboxypentyl)-1′-propylindocarbocyaninehalinge(Cy3)N-hydroxy-succinimidylester]和1-(5-羧戊基)-1′-甲基靛碳氰鹵化物(Cy5)N-羥基琥珀酸酯[1-(5-carboxypentyl)-1′-methylindocarbocyaninehalinge(Cy5)N-hydroxy-succinimidylester]標(biāo)記。在DIGE時(shí),由于樣品和對(duì)照在同一膠內(nèi)分離,使用相同的內(nèi)標(biāo),避免了使用不同凝膠時(shí)在操作上的偶然性和不平行性,可以準(zhǔn)確檢測(cè)出兩個(gè)不同樣品蛋白表達(dá)上的差別,消除膠與膠之間的差異,保證統(tǒng)計(jì)上的可靠性及操作上的重復(fù)性。熒光標(biāo)記較其他染色方法靈敏度更高。與常規(guī)的雙向電泳技術(shù)比較,DIGE更加簡(jiǎn)單,勞動(dòng)強(qiáng)度大大降低,效率大大提高。

1•2•2多維液相色譜-質(zhì)譜技術(shù):液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀用于小分子和大分子的分離和鑒定是一項(xiàng)常規(guī)而重要的技術(shù),將液相色譜和質(zhì)譜用于蛋白質(zhì)組的研究,尤其是差異表達(dá)蛋白質(zhì)組的研究,是最近才發(fā)展起來(lái)的。目前,利用多維液相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行差異表達(dá)蛋白的研究,通常要借助于同位素標(biāo)記技術(shù),也即是下面所述的ICAT技術(shù)。ICAT技術(shù)是指采用同位素標(biāo)記多肽或蛋白質(zhì)的親和標(biāo)簽技術(shù)(isotopecoded-affinitytags,ICAT),可以較準(zhǔn)確的鑒定出不同狀態(tài)細(xì)胞或組織中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。目前的ICAT試劑,大多是用來(lái)標(biāo)記磷酸化蛋白的[8]。對(duì)于酵母和細(xì)菌細(xì)胞,可在培養(yǎng)基中加入同位素進(jìn)行標(biāo)記。另外,在蛋白酶解的過(guò)程中,可采用18O對(duì)蛋白樣品的片段進(jìn)行標(biāo)記,而對(duì)照品不用同位素標(biāo)記。當(dāng)使用胰酶、Glu-C或Lys-C等蛋白酶時(shí),可分別引入2個(gè)18O到正在被酶解的肽中?，F(xiàn)在流行的市售ICAT試劑由美國(guó)華盛頓大學(xué)GygiSP教授[9]等人首先報(bào)道。此ICAT試劑的結(jié)構(gòu)包括三個(gè)部分:生物素親和標(biāo)簽,用于分離ICAT標(biāo)記的多肽;中部的連接子,使引入的同位素更穩(wěn)定;反應(yīng)活性基團(tuán),可和半胱氨酸的巰基發(fā)生特異性反應(yīng)。此試劑以兩種形式存在,重試劑(含同位素氘)和輕試劑(不含同位素),前者的質(zhì)量數(shù)比后者多8。利用ICAT試劑標(biāo)記蛋白,尋找差異表達(dá)蛋白質(zhì)的原理是:當(dāng)樣品和對(duì)照分別用重試劑和輕試劑標(biāo)記后,將兩樣品混合,酶解,過(guò)鏈親和素柱,使ICAT標(biāo)記的肽片段吸附在鏈親和素柱上。將ICAT標(biāo)記的肽洗脫下來(lái),經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜分析。樣品和其對(duì)照表達(dá)量的差別可用質(zhì)譜峰的強(qiáng)度(面積)進(jìn)行定量。將所得的差別峰經(jīng)進(jìn)一步的串聯(lián)質(zhì)譜分析,數(shù)據(jù)庫(kù)搜索,從而鑒定出相應(yīng)的差異表達(dá)蛋白質(zhì),并進(jìn)行進(jìn)一步的功能鑒定,如Westernblot等。用這種ICAT試劑尋找差異表達(dá)蛋白的缺點(diǎn)是只對(duì)含半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)有效,而不能測(cè)定其它的蛋白質(zhì)和多肽。

2疾病診斷與藥物開發(fā)

蛋白質(zhì)組學(xué)方法除了在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中用于尋找差異表達(dá)蛋白質(zhì),進(jìn)而找出疾病相關(guān)蛋白質(zhì)外,在疾病基因組學(xué)與藥物基因組學(xué)的研究中還具有以下幾個(gè)方面的作用。

2•1鑒定和疾病相關(guān)的生物標(biāo)記分子

蛋白質(zhì)組學(xué)方法在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中的優(yōu)點(diǎn)在于,可以高通量的方式篩選和鑒定和疾病相關(guān)的生物標(biāo)記分子,用于臨床診斷。HeineG[10]等人利用腦脊液作材料,經(jīng)過(guò)雙向電泳分離后的蛋白斑點(diǎn),用液相色譜-質(zhì)譜分離鑒定,得到了腦脊液的高分辨率肽譜。因腦脊液的肽中包括許多激素、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子,在生物體中起著關(guān)鍵作用,它們以多種方式反映機(jī)體體內(nèi)平衡中和疾病相關(guān)的變化,如果能從這些肽中鑒定出疾病相關(guān)的標(biāo)記分子,將可從肽水平上調(diào)查中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病,因而是一種疾病診斷和治療的新方法。KuererHM[11]等人利用高通量的雙向電泳技術(shù),分析乳腺管流體(breastductalfluid)中生化和細(xì)胞成分,以監(jiān)測(cè)乳腺癌的發(fā)生和進(jìn)展情況。BrunagelG[12]等人則根據(jù)核基質(zhì)蛋白和結(jié)腸癌的相關(guān)性,利用雙向電泳技術(shù)鑒定病人的肝樣品中是否有核基質(zhì)蛋白,從而判斷結(jié)腸癌病人是否發(fā)生肝轉(zhuǎn)移,以此作為結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的早期診斷。對(duì)于蛋白芯片技術(shù),在基礎(chǔ)研究中常用于檢測(cè)蛋白質(zhì)修飾、表征蛋白質(zhì)相互作用、信號(hào)傳導(dǎo)以及酶動(dòng)力學(xué)研究等。在臨床上,廣泛用于尋找疾病相關(guān)的生物標(biāo)記分子和疾病診斷。WuW[13]等用SELDI-蛋白芯片技術(shù)鑒定了來(lái)自同一病人的兩種頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株HBSCC10A和VMSCC10B中蛋白的差異表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),α-烯醇酶、annexin-Ⅰ和annex-in-Ⅱ是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的重要分子,以這些分子作為生物標(biāo)記分子,用于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的臨床診斷。對(duì)于多維液相或毛細(xì)管液相色譜-質(zhì)譜技術(shù),由于可進(jìn)行連續(xù)和微量檢測(cè),在尋找疾病相關(guān)的生物標(biāo)記分子方面具有超強(qiáng)的靈敏度?？蛇M(jìn)行大體積、低豐度蛋白的分析,如對(duì)血清樣品[14]和尿液[15]進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。

2•2藥物開發(fā)

因?yàn)榈鞍踪|(zhì)直接決定生物體處于健康或疾病狀態(tài),所以,蛋白質(zhì)可作為藥物設(shè)計(jì)和開發(fā)的藥靶。利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究健康或疾病生物體蛋白間的相互關(guān)系、疾病病理基礎(chǔ)、鑒定藥物成分、毒性和作用機(jī)理,從而改進(jìn)藥效和藥物安全性。MujerCV[16]等利用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù),分析了布魯氏桿菌(Brucellamelitensis,BM)的蛋白質(zhì)組。BM是一種細(xì)胞內(nèi)兼性革蘭氏陰性桿菌,可引起人或動(dòng)物的布魯氏熱(brucellosis)。此桿菌的一個(gè)屬中至少有6個(gè)種。利用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù),分析了BM致病株16M的蛋白表達(dá)模式,并鑒定了所有表達(dá)的蛋白質(zhì),對(duì)6種布魯氏桿菌減毒疫苗Rev1的蛋白圖譜進(jìn)行了廣泛研究。從而為發(fā)展疫苗,鑒定致病島(patho-genicityisland),建立宿主專一性、進(jìn)化相關(guān)性及疾病治療和藥物開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

2•3致病機(jī)理研究

用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中某些蛋白或多肽水平的變化,從而了解疾病發(fā)生的機(jī)理,如對(duì)慢性髓性白血病(chronicmyeloidleukemia,CML)分子機(jī)理的研究[17]。此病為造血干細(xì)胞疾病,標(biāo)記分子為Bcr-Abl蛋白酪氨酸激酶。讓全能的骨髓干細(xì)胞株(FDCP-Mix)有條件的表達(dá)Bcr-Abl蛋白酪氨酸激酶,從而使FDCP-Mix細(xì)胞株長(zhǎng)期暴露于Bcr-Abl中,模擬CML疾病進(jìn)程。用長(zhǎng)期暴露和短期暴露進(jìn)行對(duì)照,用MALDI-Tof質(zhì)譜或LC-MS進(jìn)行鑒定。分析結(jié)果表明,白三烯(Leukotriene)A4水解酶的表達(dá)上調(diào),AnnexinⅥ、液泡ATP合成酶催化亞單位A及mortain的表達(dá)下調(diào),表明這些分子在CML的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。將蛋白質(zhì)組學(xué)方法用于疾病機(jī)理研究的例子很多,這里不再贅述。

3結(jié)束語(yǔ)

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)展的日益成熟,其在疾病基因組和藥物基因組研究中的應(yīng)用將越來(lái)越廣泛。人們不僅可以找到疾病相關(guān)的基因,還可搞清楚疾病發(fā)生的機(jī)理,鑒定出疾病相關(guān)的生物標(biāo)記分子,以便用于臨床診斷。在藥物設(shè)計(jì)中找到合適的藥靶,開發(fā)出高效快捷的藥物,用于疾病治療。可以預(yù)見,在不久的將來(lái),許多危害人類的頑癥,如糖尿病、艾滋病、高血壓等,將會(huì)隨著人類基因組的破譯和蛋白質(zhì)組功能分析的完成而被徹底攻克。