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【摘要】目的采用瘤塊種植法制備脊柱腫瘤動(dòng)物模型。方法將SHZ-88大鼠乳腺癌細(xì)胞株接種雌性SD乳鼠,成瘤后植入去胸腺SD大鼠腰椎內(nèi),制成大鼠脊柱種植性腫瘤的動(dòng)物模型。結(jié)果瘤塊植入術(shù)后15d病變節(jié)段大體標(biāo)本見(jiàn)椎體表面有明顯隆起的軟組織腫塊形成,包裹部分椎體表面;矢狀面見(jiàn)椎體骨質(zhì)凹陷,為腫瘤組織呈魚(yú)肉樣,腫瘤組織向周?chē)琴|(zhì)浸潤(rùn);病理切片證實(shí)腫瘤形成。模型組成瘤率80%。結(jié)論瘤塊種植法可構(gòu)建大鼠脊柱種植性腫瘤模型。

【關(guān)鍵詞】脊柱疾病;脊椎腫瘤;疾病模型,動(dòng)物

ABSTRACT:ObjectiveToestablishaspinaltumormodelwiththetumorsegmentplantmethod.MethodsSHZ-88mammarycancercelloftheratwasasubcutaneousinjectedintofemalenewbornrattoproducesubcutaneouslump.Thentumorsegmentswereplantedintothelumbarvertebralofthefemalethymectomizesrats,toestablishratspinaltumormodel.ResultsTheinvolvedvertebralbodieswasobservedencapsulatepartsofthevertebralbody,at15daysafterthesurgery.Bonedefectcanbeseeninthesagittalplane,tumortissueappearsgray-whiteincolorandinfiltrationintothevertebralbody.Themodelofspinaltumorwasestablishedin80%rats.ConclusionSpinaltumormodelinratsimulatedthemalignanttumorcharacter,whichhasgreatsignificationinthestudythecharacterofthemetastasisspinalneoplasms,andcomparisonsofthecurativeeffectsofdifferenttherapies.

KEYWORDS:spinaldisease;spinalneoplasms;diseasemodels,animal

良好的腫瘤動(dòng)物模型要具備以下特點(diǎn):相似性、可重復(fù)性、可靠性、適用性、可控性、易行性及經(jīng)濟(jì)性等［1］。目前常用的骨腫瘤動(dòng)物模型方法有誘導(dǎo)法和移植法［2］,其中通過(guò)移植法建立骨腫瘤模型具有特性明確、生長(zhǎng)一致性好、實(shí)驗(yàn)周期短,可反復(fù)復(fù)制等特點(diǎn),因此廣為采用。在臨床上脊柱腫瘤多為轉(zhuǎn)移性,且病期較晚［3］。建立脊柱轉(zhuǎn)移性腫瘤的動(dòng)物模型,有助于研究脊柱轉(zhuǎn)移性腫瘤的相關(guān)特性,比較各種治療方法的療效。筆者采用SHZ-88大鼠乳腺癌細(xì)胞株接種雌性SD乳鼠,成瘤后植入去胸腺SD大鼠腰椎內(nèi),初步建立大鼠脊柱種植性腫瘤模型。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞與動(dòng)物

SHZ-88大鼠乳腺癌細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所)。SD大鼠(清潔級(jí))由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［許可證號(hào)SCXK(滬)2007-300-5］,體質(zhì)量(420±20)g。

1.1.2主要試劑

PBS緩沖液(美國(guó)Gibco公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司),FCS-1640培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco公司),0.25%胰蛋白酶Trypsin(美國(guó)Gibco公司),水合氯醛(上海山浦化工有限公司)。

1.1.3主要儀器

生物潔凈工作臺(tái)(AIR-TECHBCM-1000A型,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。CO2培養(yǎng)箱(3111型,美國(guó)ThermoForma公司)。1×70熒光倒置式相差顯微鏡(日本Olympus公司)。光學(xué)顯微鏡(BH-2型,日本Olympus公司)。顯微外科手術(shù)器械、玻璃培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、X線攝片機(jī)(美國(guó)Kodak公司)。

1.2方法

1.2.1乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)

SHZ-88大鼠乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的FCS1640培養(yǎng)液,隔天換液,2~3d傳1代。

1.2.2建立脊柱腫瘤動(dòng)物模型

1.2.2.1皮下腫瘤模型

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化后,用無(wú)血清的培養(yǎng)液稀釋成1×107mL,各取0.3mL注入8只7日齡雌性SD大鼠右腋皮下,并用棉簽局部壓迫1min,防止懸液漏出。每日觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。瘤塊增大至約1.5cm×1.0cm,取腫瘤組織用10%福爾馬林溶液固定,作病理切片,H-E染色。

1.2.2.2去胸腺模型

參照文獻(xiàn)［4］方法去除SD大鼠的胸腺。

1.2.2.3脊柱腫瘤模型

將去胸腺SD大鼠20只,隨機(jī)分為模型組與對(duì)照組,每組10只。10%水合氯醛麻醉、固定、消毒。取腹部正中切口,逐層進(jìn)入腹腔,暴露腹腔后壁。以旋髂深動(dòng)脈為定位標(biāo)志,打開(kāi)后腹膜,顯露第6腰椎,用磨鉆在椎體上開(kāi)口,并在椎體中磨造出一個(gè)口小底大的空腔(圖1)。取皮下腫瘤瘤體,置于無(wú)血清培養(yǎng)液中,剪成直徑約0.5mm瘤塊。將瘤塊填入模型組椎體空腔內(nèi),對(duì)照組不填入瘤塊,用骨蠟封閉開(kāi)口,逐層縫合。每日觀察大鼠生長(zhǎng)情況,第2周X線攝片檢查腫瘤生長(zhǎng)情況,處死后取出椎體標(biāo)本,病理切片,H-E染色檢查。

2結(jié)果

2.1大鼠乳腺癌細(xì)胞

SHZ-88大鼠乳腺癌細(xì)胞呈單層貼壁樣生長(zhǎng),光鏡下見(jiàn)細(xì)胞為多邊形,少數(shù)梭形,樹(shù)枝樣突起,細(xì)胞大小不一,可見(jiàn)多倍體細(xì)胞,核分裂相易見(jiàn),并出現(xiàn)病理性核分裂。SHZ-88大鼠乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的FCS1640培養(yǎng)液中,細(xì)胞增殖迅速,2~3d即可貼滿瓶壁。

2.2皮下腫瘤模型

細(xì)胞接種當(dāng)天局部可見(jiàn)由細(xì)胞懸液形成的液泡,第2日液泡吸收,局部變平整。接種5d后可觸及皮下結(jié)節(jié),其后瘤塊生長(zhǎng)迅速,接種12d左右后瘤塊可增大至約1.5cm×1.0cm,成瘤率100%。腫瘤組織呈魚(yú)肉樣,并可見(jiàn)壞死,病理切片H-E染色見(jiàn)腫瘤細(xì)胞交織排列,大小不一,形態(tài)不規(guī)則,異形性明顯,細(xì)胞核大小不一,深染,病理性核分裂像易見(jiàn)。

2.3去胸腺模型

為提高成年SD大鼠的成瘤率,先行胸腺摘除,破壞其自身免疫系統(tǒng)。分離胸腺兩葉下極時(shí),切口即與胸腔相通,出現(xiàn)氣胸癥狀,應(yīng)迅速游離下極摘除胸腺,收緊縫線,關(guān)閉切口,并立即對(duì)右胸腔穿刺抽氣,癥狀可迅速緩解。大鼠胸腺分為左右兩葉,應(yīng)仔細(xì)檢查取出的胸腺組織是否完整,若不完整,則不能作為去胸腺鼠模型。脊柱腫瘤植入手術(shù)在術(shù)后5d后進(jìn)行,以恢復(fù)大鼠對(duì)后續(xù)手術(shù)的耐受力。

2.4脊柱乳腺癌種植瘤模型

術(shù)中、術(shù)后均無(wú)死亡。術(shù)后3d內(nèi),在飲水中加入適量抗生素,預(yù)防切口感染。2組切口愈合較好,未見(jiàn)明顯感染者。部分出現(xiàn)左下肢跛行,可能系術(shù)中剝離腰大肌時(shí)神經(jīng)牽拉引起,于術(shù)后5~10d內(nèi)均恢復(fù)正常。術(shù)后15d時(shí)X線檢查見(jiàn)植入部位椎體前緣凹陷,瘤塊植入組椎體骨質(zhì)密度較對(duì)照組略有改變,但不明顯(圖2)。處死后,顯露腫瘤植入椎體,模型組8只見(jiàn)椎體表面有隆起的軟組織腫塊,其余未見(jiàn)腫瘤生長(zhǎng)。對(duì)照組均未見(jiàn)腫瘤生長(zhǎng)。15d2組均未見(jiàn)明顯神經(jīng)功能改變。暴露病變節(jié)段的椎體,模型組8見(jiàn)椎體表面有軟組織腫塊形成,成瘤率為80%,而對(duì)照組中未見(jiàn)腫瘤形成。

2.5腫瘤病理學(xué)

病變節(jié)段大體標(biāo)本見(jiàn)椎體表面有明顯隆起的軟組織腫塊形成,包裹部分椎體表面,矢狀面上見(jiàn)椎體骨質(zhì)凹陷,為腫瘤組織呈魚(yú)肉樣,已填滿空腔。鏡下見(jiàn)腫瘤周?chē)琴|(zhì)吸收,形成的骨質(zhì)缺損較原有的空腔大,腫瘤組織向周?chē)琴|(zhì)浸潤(rùn),形成一半環(huán)形浸潤(rùn)帶。椎體中央見(jiàn)一腫瘤組織,并向周?chē)切×褐薪?rùn)生長(zhǎng)(圖3),但未突破椎體后壁。

3討論

3.1本脊柱腫瘤動(dòng)物模型的特點(diǎn)

SHZ-88大鼠乳腺癌細(xì)胞株是南京鐵道醫(yī)學(xué)院于1987年用7,12-二甲基苯蒽(DMBA)在雌性SD大鼠上誘導(dǎo)形成后,將癌組織體外培養(yǎng)傳代后形成［5］。SHZ-88細(xì)胞生物學(xué)特性穩(wěn)定,具備快速生長(zhǎng)的惡性腫瘤細(xì)胞特點(diǎn),在同種動(dòng)物體內(nèi)具有致瘤性,是研究腫瘤特性的良好體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?］。在本實(shí)驗(yàn)以SHZ-88細(xì)胞接種于雌性SD乳鼠中,成瘤率達(dá)100%。乳腺癌是最容易發(fā)生脊柱轉(zhuǎn)移的癌癥之一,因此采用乳腺癌細(xì)胞作為種子細(xì)胞制備脊柱轉(zhuǎn)移性腫瘤動(dòng)物模型能提高模型制備的成功率,及臨床生物學(xué)特性的相似性。本實(shí)驗(yàn)中為進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)的成功率,所有待移植乳腺癌瘤塊的SD大鼠均先期行胸腺摘除術(shù),降低大鼠的自身免疫力,提高模型成功率。

瘤塊植入以后位于腹腔內(nèi),無(wú)法直接觀察腫瘤的生長(zhǎng),由于大鼠的脊柱骨質(zhì)較少,即使有腫瘤病變,在X線下的表現(xiàn)也不甚明顯。判斷腫瘤的生長(zhǎng)情況主要還是依據(jù)處死后取出的病理標(biāo)本判斷。在處理組中成瘤率達(dá)80%,說(shuō)明該模型有較高的成功率。大體標(biāo)本顯示為腫瘤組織呈魚(yú)肉樣,已填滿空腔,周?chē)琴|(zhì)吸收,形成的骨質(zhì)缺損較原有的空腔大,腫瘤組織向周?chē)琴|(zhì)浸潤(rùn),在椎體中形成一半環(huán)形與周?chē)９墙M織不同浸潤(rùn)帶,說(shuō)明該腫瘤模型的生長(zhǎng)特性與人類(lèi)腫瘤相似。人類(lèi)脊柱腫瘤的一個(gè)重要臨床特點(diǎn)是椎體骨質(zhì)破壞后,椎體壓縮造成脊髓壓迫癥狀。Mantha等報(bào)道應(yīng)用大鼠乳腺癌細(xì)胞株CRL-1666建立大鼠移植性脊柱轉(zhuǎn)移瘤的方法中,在瘤塊植入10~15d后,植入組出現(xiàn)下肢功能的障礙［7］。但在本組實(shí)驗(yàn)中并未出現(xiàn)脊髓壓迫引起的下肢功能障礙。究其原因可能有:(1)大鼠為爬行動(dòng)物,脊柱的受力與人類(lèi)不同,椎體破壞后,沿椎體縱軸的壓縮力較小,尚不能引起椎體壓縮;(2)SHZ-88細(xì)胞侵襲較弱,無(wú)法在短時(shí)間內(nèi)突破椎體后壁,侵入椎管內(nèi)壓迫脊髓;(3)骨蠟與椎體表面骨組織的結(jié)合力差,椎體磨造的開(kāi)口用骨蠟封閉后可能脫落,導(dǎo)致腫瘤向前方阻力小的方向生長(zhǎng)。此不足有待日后實(shí)驗(yàn)中近一步改進(jìn)。

3.2制作脊柱腫瘤模型的常見(jiàn)并發(fā)癥及預(yù)防

瘤塊植入手術(shù)可能出現(xiàn)的并發(fā)癥:(1)腹部大血管損傷。瘤塊植入后需縫合兩側(cè)腰大肌防止瘤塊脫出,腹部的大血管多位于左側(cè)腰大肌前方,易損傷,在縫合時(shí)最好先將大血管適當(dāng)分離,向左側(cè)牽開(kāi)。(2)腰神經(jīng)損傷。在分離附著于椎體表面的腰大肌時(shí)可能造成腰神經(jīng)的牽拉損傷,術(shù)后出現(xiàn)跛行癥狀,于術(shù)后5~10d內(nèi)均可恢復(fù)正常。(3)脊髓損傷。用磨鉆在椎體上磨造容納瘤塊的空腔時(shí),應(yīng)注意控制深度,以防穿出椎體后壁,損傷脊髓。術(shù)后可能出現(xiàn)的并發(fā)癥有切口感染,腹腔內(nèi)感染等,注意手術(shù)過(guò)程中的無(wú)菌操作,術(shù)后給予適當(dāng)?shù)目垢腥局委煹却胧?可避免。

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