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摘要：人類(lèi)胚胎干細(xì)胞(HESCs)在人類(lèi)發(fā)育生物學(xué)研究及再生醫(yī)學(xué)中具有重要的應(yīng)用前景。人們?cè)贖ESCs建系及其分化研究上已取得一些進(jìn)展，但各個(gè)細(xì)胞系的生物學(xué)特性有一定差異，文章討論了有關(guān)HESCs的標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)問(wèn)題。

關(guān)鍵詞：標(biāo)準(zhǔn)；人類(lèi)胚胎干細(xì)胞

作為人類(lèi)早期胚胎學(xué)研究的窗口及其在再生醫(yī)學(xué)中的潛在應(yīng)用，HESCs研究顯得非常重要。一些研究人和動(dòng)物胚胎系統(tǒng)發(fā)生學(xué)的分子生物學(xué)家對(duì)HESCs功能性分析的分子學(xué)和細(xì)胞學(xué)標(biāo)準(zhǔn)作了一些評(píng)述，并指出未來(lái)一些重要的研究方法和途徑。本文討論了HESCs的研究進(jìn)展，旨在就HESCs評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行科學(xué)討論。

1HESCs的基本特點(diǎn)

胚胎干細(xì)胞(ESCs)有兩個(gè)比較顯著的特征：①可以自我更新并保持多能性和未分化狀態(tài)；②具有分化為多種特定細(xì)胞類(lèi)型的能力。HESCs來(lái)源于人類(lèi)早期胚泡(受精后5d)的胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)。正如鼠胚胎干細(xì)胞(MESCs)一樣，HESCs具有以下幾個(gè)基本特點(diǎn)：①核型正常；②體外適宜培養(yǎng)條件下可無(wú)限擴(kuò)增和存活；⑧冷凍和解凍后多數(shù)細(xì)胞可以復(fù)蘇；④體內(nèi)外可以分化為多種細(xì)胞類(lèi)型。HESCs的這些特點(diǎn)已得到了確認(rèn)，但一些重要問(wèn)題還有待解決。

2新的HESCs系的建立

許多國(guó)家暫停資助用于HESCs研究的國(guó)家基金，使HESCs建系研究受到限制，但由于已有經(jīng)驗(yàn)及其誘人的應(yīng)用前景，眾多科學(xué)家及一些私人研究機(jī)構(gòu)都在競(jìng)相從事HESCs研究。相信會(huì)有更多新的HESCs系的建立。

3HESCs培養(yǎng)條件

目前，分離HESCs的方案均源自于MESCs的相關(guān)資料。即用免疫外科法分離得到人類(lèi)胚泡ICM，無(wú)Ca2+-Mg2+培養(yǎng)液離散后培養(yǎng)在經(jīng)處理以抑制其擴(kuò)增的MEF或人類(lèi)飼養(yǎng)層細(xì)胞上。資料報(bào)道適宜培養(yǎng)條件下HESCs可在體外未分化狀態(tài)下存活許多代(高達(dá)8O代)。

除了特定生長(zhǎng)因子需求外，HESCs培養(yǎng)條件與小鼠相似。MESCs需要細(xì)胞因子如白血病抑制因子(LIF)，維持其多能性和未分化狀態(tài)，而HESCs多能性維持則不依賴(lài)于LIF，MEF條件培養(yǎng)基是否維持HESCs多能性的信號(hào)分子尚未確定。另外，在培養(yǎng)過(guò)程中，HESCs同其它人類(lèi)細(xì)胞一樣需要成纖維細(xì)胞因子促其生長(zhǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中HESCs的長(zhǎng)細(xì)胞周期影響其對(duì)不同培養(yǎng)條件的反應(yīng)，且在許多方面與MESCs不同。

4HESC自我更新的調(diào)節(jié)

LIF對(duì)MESCs未分化狀態(tài)的有效維持是通過(guò)膜蛋白gpl30和stat3信號(hào)途徑的激活來(lái)實(shí)現(xiàn)的。雖然，HESCs不需要LIF保持未分化狀態(tài)，但(gpl30、JAK／STAT)下游信號(hào)途徑是否參與維持其未分化狀態(tài)尚未研究。HESCs和MESCs所共有信號(hào)途徑的程度將決定MESCs實(shí)驗(yàn)方案適用于HESCs的程度。

5所有的HESCs系都相同嗎?

HESCs研究的一個(gè)相關(guān)問(wèn)題是胚胎中存在多少種干細(xì)胞狀態(tài)?對(duì)這些問(wèn)題的進(jìn)一步研究需要比較不同HESCs系之間未分化狀態(tài)下多能性分子標(biāo)記物以及細(xì)胞特點(diǎn)和多潛能性。這些研究在MESCs上已取得了很大進(jìn)展，但HESCs上尚未開(kāi)始。目前研究人員用一些MESCs的分子標(biāo)記對(duì)HESCs系進(jìn)行檢測(cè)。這些標(biāo)記物在ESC中普遍表達(dá)豐富，我們建議將這些標(biāo)記物分為兩類(lèi)。I類(lèi)標(biāo)記物為明確定義的克隆化標(biāo)記物，Ⅱ類(lèi)為需要進(jìn)一步多方面鑒定的標(biāo)記物。并非所有的小鼠標(biāo)記物均在人類(lèi)細(xì)胞中表達(dá)。例如：SSEA一3和SSEA-4在HESCs表達(dá)，而在MESCs不表達(dá)；而MESCs表達(dá)SSEA一1，但HESCs不表達(dá)。確信，隨著對(duì)MESCs和HESCs深入研究和分析，會(huì)迅速得到許多ESCs標(biāo)記物，這些特異性表達(dá)標(biāo)記有助于規(guī)范HESC定義。

HESCs的分子標(biāo)記。表1中所列13種分子標(biāo)記都是鑒定未分化HESCs的。這些標(biāo)記在未分化HESCs中表達(dá)(豐富)，分化后則消失。它們可分為兩類(lèi)：I類(lèi)，明確定義的克隆化標(biāo)記物，II類(lèi)，需多方面鑒定的抗體檢測(cè)細(xì)胞表面抗原。

6HESCs可進(jìn)行怎樣的遺傳操作?

已有HESCs成功轉(zhuǎn)染操作基因并表達(dá)該基因的大量文獻(xiàn)報(bào)道。人類(lèi)反轉(zhuǎn)錄病毒載體(例如痘病毒)以及生化策略表明了基因轉(zhuǎn)染HESCs的可能。如果HESCs用于醫(yī)療，克隆到病毒載體內(nèi)的轉(zhuǎn)染基因的隨機(jī)整合應(yīng)引起足夠重視。MESCs的位點(diǎn)特異性重組(剔除或剔入)功能缺失實(shí)驗(yàn)，最近在HESCs上也有了類(lèi)似報(bào)道，使HESC的遺傳操作成為可能。

7為何加強(qiáng)HESCs研究?

包括小鼠在內(nèi)的各種動(dòng)物構(gòu)成其于細(xì)胞生物學(xué)的分子特征我們還不是很清楚，但是MESCs和HESCs間的差異已十分顯著。例如培養(yǎng)中的MESCs生長(zhǎng)速度明顯快于HESCs；參與MESCs自我更新的配體已確認(rèn)，MESCs通過(guò)遺傳操作的胚胎獲得；而且MESCs更適于作各種體內(nèi)實(shí)驗(yàn)而不受政治和倫理的影響。相反，HESCs很難得到且生長(zhǎng)慢；其自我更新的分子機(jī)制還不清楚。HESCs也很難進(jìn)行遺傳操作和體內(nèi)試驗(yàn)。顯然，討論有關(guān)HESCs和MESCs的基本問(wèn)題同樣重要。

由于兩者存在差異，如果HESCs可應(yīng)用于臨床，非模型系統(tǒng)HESCs研究將很有必要。

8HESCs是怎樣進(jìn)行分化的?

體外，HESCs可分化為三個(gè)胚層的多種細(xì)胞類(lèi)型(但不是全部)。培養(yǎng)的HESCs可分化為神經(jīng)細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、(表明外胚層分化)，血液，肌肉，軟骨，內(nèi)皮細(xì)胞以及心肌細(xì)胞(表明中胚層分化)，還可分化成胰島細(xì)胞(表明內(nèi)胚層分化)。另外，HESCs還可形成包括三個(gè)胚層的類(lèi)胚體。雖然，HESCs的體外分化潛能與MESCs相當(dāng)，但是目前還不清楚，這些分化是發(fā)生在正常的胚胎形成過(guò)程還是通過(guò)其它途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的?

發(fā)育決定具有時(shí)序性，在具體器官和特定細(xì)胞類(lèi)型形成前，胚胎(包括HESCs)要產(chǎn)生三個(gè)胚層：外胚層、中胚層、內(nèi)胚層。探尋器官形成的分子途徑，需要確定哪些活動(dòng)為特定類(lèi)型細(xì)胞形成所必需。例如：通過(guò)特定處理促進(jìn)HESCs分化為特定內(nèi)胚層如胰島細(xì)胞。因此，在細(xì)胞完成其最終命運(yùn)前及時(shí)分化對(duì)于解釋細(xì)胞生長(zhǎng)中的中間歷程很重要。理解正常的發(fā)育過(guò)程有助于我們?cè)O(shè)計(jì)ESCs促分化程序。雖然在動(dòng)物模型胚胎中存在許多胚層標(biāo)記物，但在人類(lèi)胚胎中目前還沒(méi)有全面分析這些標(biāo)記物。ESCs被定義為在體內(nèi)能產(chǎn)生所有3個(gè)胚層和生殖系的一種細(xì)胞，將標(biāo)記過(guò)的MESCs移植給不同階段(多為胚泡期)的小鼠胚胎，最終通過(guò)標(biāo)記細(xì)胞評(píng)價(jià)ESC其生成生殖細(xì)胞的能力。HESCs體內(nèi)分化潛能需要嚴(yán)密的檢測(cè)。由于倫理觀念，不可能將HESCs移植到人類(lèi)胚胎，唯一公開(kāi)報(bào)道的體內(nèi)分化實(shí)驗(yàn)僅是向免疫缺陷小鼠(如NOD／SCID小鼠)皮下注射HESCs，表明其分化特征類(lèi)似于MESCs。注射后的小鼠形成有3個(gè)胚層的畸胎瘤，這有助于評(píng)價(jià)HESCs的多潛能性，但仍需要其它實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)HESCs具有產(chǎn)生胚外細(xì)胞及生殖細(xì)胞系的潛能。

9HESCs分化能力分析

HESCs體內(nèi)外分析體系的改進(jìn)對(duì)了解與HESCs分化有關(guān)的生物學(xué)知識(shí)非常必要，也是其在再生醫(yī)學(xué)中應(yīng)用的前提。根據(jù)在魚(yú)類(lèi)、青蛙、雞和小鼠胚胎組織發(fā)育研究的結(jié)果已建立了一些離體分析體系。

建立體內(nèi)分析體系比離體分析體系要困難。依據(jù)動(dòng)物模型建立的經(jīng)驗(yàn)，設(shè)計(jì)了兩種簡(jiǎn)單的體內(nèi)試驗(yàn)，首先，將標(biāo)記過(guò)的HESCs移植入非人類(lèi)成體或胎兒特定組織的一定部位以檢測(cè)其與宿主組織整合的能力。類(lèi)似實(shí)驗(yàn)將小鼠于細(xì)胞體外分化的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞移植至雞胚，結(jié)果表明這些小鼠干細(xì)胞源神經(jīng)細(xì)胞參與脊髓形成。已有相關(guān)報(bào)道表明，人類(lèi)胎兒和成體神經(jīng)干細(xì)胞以及造血干細(xì)胞可移植至小鼠胎兒并能參與多種器官形成。第一個(gè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)特定胎兒環(huán)境的局部作用，第二個(gè)實(shí)驗(yàn)則將標(biāo)記過(guò)的HESCs移植入非人類(lèi)早期胚胎中檢測(cè)HESCs與宿主組織的整合能力。包括小鼠和雞胎胚模型系統(tǒng)的HESCs移植有助于評(píng)價(jià)HESCs參與宿主組織和器官的形成。此類(lèi)實(shí)驗(yàn)應(yīng)該是短暫的，即在妊娠的不同時(shí)期，胚胎可能被排斥；我們意識(shí)到第二個(gè)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)?shù)目茖W(xué)制度的支持。

10HESCs研究的基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)

由于生物材料來(lái)源限制，HESCs研究的基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)尤為重要。作者建議建立HESCs貯藏庫(kù)并注冊(cè)，類(lèi)似于英國(guó)提議的干細(xì)胞庫(kù)，這個(gè)貯藏庫(kù)收集所有HESCs系(包括2001年8月9日后所有建系)，用上述標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其標(biāo)準(zhǔn)化并保證學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)研究應(yīng)用，質(zhì)量監(jiān)控和規(guī)則可參照一些已建立的中心體系如美國(guó)標(biāo)本培養(yǎng)收藏協(xié)會(huì)。貯藏庫(kù)要負(fù)責(zé)HESCs的收集和供給，這將有助于解決研究者的困境。HESCs貯藏庫(kù)應(yīng)包括一個(gè)大學(xué)機(jī)構(gòu)和研究人員都可獲得的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)，此數(shù)據(jù)庫(kù)收集所有有關(guān)HESCs和人類(lèi)胚胎的數(shù)據(jù)。注冊(cè)點(diǎn)向許多地區(qū)提供和獲得相關(guān)資料，包括微陣列分析結(jié)果(原始數(shù)據(jù))或一些細(xì)胞傳代法，HESCs系的生長(zhǎng)和培養(yǎng)條件，分化潛能以及鑒定方法。

這需要特別重視兩個(gè)方面，首先已有資料(如原始微陣列數(shù)據(jù))的質(zhì)量監(jiān)控必須為一個(gè)委員會(huì)嚴(yán)格限定和擁有。作者建議這個(gè)委員會(huì)由一些具有分子胚胎學(xué)、高質(zhì)量數(shù)據(jù)分析以及生物信息學(xué)專(zhuān)業(yè)知識(shí)的科學(xué)家組成。

其次，資料信息的保存和累積需要長(zhǎng)期的義務(wù)性努力。本文所述僅是一個(gè)起點(diǎn)，期望隨著有關(guān)HESCs和人類(lèi)胚胎學(xué)知識(shí)的不斷豐富，HESCs標(biāo)準(zhǔn)會(huì)更加具體和豐富。