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摘要】目的考察口服硫酸亞鐵（FeSO4）對三硝基苯磺酸（TNBS）誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎（UC）模型大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響。方法采用TNBS乙醇溶液復(fù)制UC大鼠模型，雄性SD大鼠60只，隨機分為6組，每組10只，分別為正常對照組、模型對照組、FeSO4對照組（100mg·kg-1·d-1）和FeSO4低劑量組（50mg·kg-1·d-1）、中劑量組（100mg·kg-1·d-1）和高劑量組（300mg·kg-1·d-1），給藥2周后分別觀察大鼠的一般狀態(tài)、組織病理學(xué)變化、組織及血清超氧化物歧化酶（SOD）與丙二醛（MDA）水平。結(jié)果FeSO4中、高劑量組大鼠體質(zhì)量減輕，腹瀉動物數(shù)增加，結(jié)腸組織損傷加重，血清與結(jié)腸組織SOD活性降低、MDA水平升高（P<0.05）。結(jié)論UC模型大鼠體內(nèi)存在氧化應(yīng)激，口服補充FeSO4可能會進一步加劇其體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)及結(jié)腸組織病理學(xué)損傷。

【關(guān)鍵詞】硫酸亞鐵;潰瘍性結(jié)腸炎;三硝基苯磺酸;氧化應(yīng)激;大鼠

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerativecolitis，UC）是一種病因不明的直腸和結(jié)腸慢性非特異性炎癥，臨床主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的腹痛、腹瀉及黏液膿血便，重癥或病情持續(xù)活動的患者可出現(xiàn)缺鐵性貧血。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，給予UC患者口服鐵劑不能很好地被耐受，甚至?xí)又匚改c道癥狀或促進疾病活動［1］。硫酸亞鐵（ferroussulfate，F(xiàn)eSO4）是臨床最為常用的鐵劑之一，同時也是一種強氧化劑，可能會因產(chǎn)生自由基（oxygen-derivedfreeradicals，OFR）而加重組織損傷［2］。本實驗利用三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzenesulfonicacid，TN-BS）復(fù)制UC模型，觀察FeSO4對UC模型大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響，為臨床治療提供依據(jù)。

1材料和方法

1.1藥物和試劑

TNBS購于Sigma公司，5%（W/V）水溶液，批號為P2297;FeSO4，上海黃浦制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號為050606，輕輕把FeSO4片研碎，稱取一定量的粉末，加入蒸餾水配成100mg·ml-1的混懸液備用;丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、考馬斯亮蘭蛋白檢測試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，批號為20060323。

1.2動物

雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量200～220g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，普通級。

1.3儀器

756MC紫外分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司），TGL-16H高速離心機（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司），可控式硅恒溫水浴鍋（上海錦屏儀器儀表有限公司），QL-901漩渦混合器（江蘇海門麒麟醫(yī)用儀表廠），電子分析天平（上海天平儀器廠），DIAX-900內(nèi)切式組織勻漿機（德國Heidolph公司）。

1.4大鼠UC模型制備［3］

健康大鼠60只，隨機分為6組。留2組作正常對照組與FeSO4對照組，余4組均制備模型，禁食不禁水24h后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（1ml·kg-1）使大鼠輕微麻醉后，將直徑2mm的乳膠管經(jīng)肛門輕輕插入大鼠體內(nèi)大約8cm處，將TNBS（125mg·kg-1）的50%乙醇溶液緩緩注入到大鼠腸腔內(nèi)，提起大鼠尾部，倒置30s，使造模劑充分滲入大鼠腸腔。

1.5分組及給藥

將正常大鼠隨機分為正常對照組與FeSO4對照組，每組10只;將造模大鼠隨機分為模型對照組，F(xiàn)e-SO4給藥高、中、低劑量組，每組10只。FeSO4對照組大鼠，按照100mg·kg-1·d-1灌胃FeSO4混懸液;Fe-SO4高、中、低劑量組大鼠，分別按照300mg·kg-1·d-1、100mg·kg-1·d-1、50mg·kg-1·d-1灌胃FeSO4混懸液;正常對照組及模型對照組大鼠每天灌胃同體積生理鹽水，各組大鼠均在造模后6h開始給藥，連續(xù)給藥2周。

1.6癥狀觀察

每天對各組大鼠進行稱重，觀察體質(zhì)量變化并記錄;觀察大鼠糞便形狀，記錄大鼠發(fā)生腹瀉、血便的數(shù)量。

1.7結(jié)腸黏膜組織損傷評分

各組大鼠給藥2周后，3%戊巴比妥鈉過量麻醉，腹主動脈取血2ml，離心后置-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。將肛門以上10cm腸段取出，沿腸系膜縱行切開，用冰生理鹽水沖洗，并稱量。將黏膜向上展開，觀察黏膜損傷并按照Wallace和Keenan1990年的評分標準［4］進行評分:0分為無炎癥和潰瘍;1分為局部充血但無潰瘍;2分為有潰瘍但無充血;3分為有1處潰瘍及炎癥;4分為有2處或2處以上潰瘍及炎癥;5分為潰瘍延伸超過2cm。同時取少量炎癥腸組織，迅速放置液氮罐中備用。

1.8病理組織切片觀察

取肛門以上8cm腸段卷起，置10%中性甲醛液中固定，石蠟包埋，行4μm厚連續(xù)切片，HE染色觀察組織學(xué)變化。

1.9生化指標測定

血清及結(jié)腸組織MDA、SOD均按照檢測試劑盒說明書進行操作。

1.10統(tǒng)計學(xué)處理

計量指標以x-±s表示，多組間比較行方差分析，各組間兩兩比較行LSD檢驗，采用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2結(jié)果

2.1一般狀態(tài)及大便性狀的變化

見表1。正常組與FeSO4對照組大鼠活動如常，反應(yīng)機警，毛發(fā)有光澤，飲食正常，體質(zhì)量增長較多，無腹瀉及便血;制模大鼠精神萎靡，毛發(fā)無光澤，飲食減少，均出現(xiàn)不同程度的腹瀉、便血。正常對照組與FeSO4對照組大鼠體質(zhì)量增加、腹瀉及便血無顯著性差異;與正常對照組比較，模型對照組大鼠體質(zhì)量增加明顯減少（P<0.01）;FeSO4中、高劑量組大鼠體質(zhì)量增加顯著低于模型對照組（P<0.05），發(fā)生腹瀉、便血動物只數(shù)明顯增多。表1各組大鼠發(fā)生腹瀉數(shù)及體質(zhì)量變化（略）

2.2結(jié)腸損傷評分及生化指標改變

見表2。觀察大鼠結(jié)腸外觀及黏膜表面發(fā)現(xiàn)，正常對照組與FeSO4對照組大鼠結(jié)腸黏膜無明顯充血水腫，未見糜爛及潰瘍灶;模型對照組大鼠的結(jié)腸多數(shù)與相鄰臟器有輕度的粘連，結(jié)腸充血水腫，在距肛門8cm的腸段有較大的潰瘍病灶，病灶處結(jié)腸壁增厚，腸黏膜表面發(fā)生潰瘍糜爛壞死，與正常對照組大鼠相比，結(jié)腸明顯變短，結(jié)腸質(zhì)量增加;FeSO4各劑量組大鼠結(jié)腸水腫、糜爛等炎性癥狀明顯加重，潰瘍面積增大。模型組結(jié)腸病理損傷評分、結(jié)腸組織和血清MDA水平均高于正常對照組（P<0.01），結(jié)腸組織和血清SOD水平均低于正常對照組（P<0.01）;與模型對照組比較，F(xiàn)e-SO4中、高劑量組結(jié)腸組織損傷評分、結(jié)腸和血清MDA水平顯著升高（P<0.05），結(jié)腸和血清SOD水平顯著降低（P<0.05），中、高劑量組之間無明顯差異;上述指標在FeSO4對照組與正常對照組未見統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。表2各組大鼠結(jié)腸損傷以及生化指標的影響（略）

2.3結(jié)腸組織病理學(xué)變化

見圖1。正常大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)清晰，黏膜完整，腸腺豐富，排列緊密（圖1A）;TNBS造模后，大鼠結(jié)腸組織黏膜壞死脫落，潰瘍形成，大量中性粒細胞浸潤，腺體消失（圖1B）;FeSO4對照組大鼠結(jié)腸組織粘膜結(jié)構(gòu)完整，未見潰瘍形成（圖1C）;FeSO4低、中、高劑量組大鼠結(jié)腸組織腸黏膜上皮脫落缺損加重、潰瘍區(qū)域明顯增大，黏膜周圍上皮增生修復(fù)減慢，炎細胞增加（圖1D～F）。

3討論

TNBS是一種半抗原，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的大鼠模型除發(fā)生腹瀉、便血、體質(zhì)量減輕等臨床癥狀外，還可以誘發(fā)大鼠腸道炎癥，腸黏膜發(fā)生潰瘍、水腫、糜爛、大量炎性細胞浸潤等組織病理學(xué)改變，類似于人類的UC，由于制備簡單省時而被廣泛應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，氧自由基在UC的發(fā)病中起重要作用，氧自由基對自身組織產(chǎn)生攻擊作用，參與并通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生炎癥介質(zhì)（白三烯、前列腺素等）活化炎癥反應(yīng)［5］。MDA是氧自由基觸發(fā)細胞膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其含量反應(yīng)了組織過氧化損傷程度，它能使腸粘膜組織損害進一步加重。MDA水平的高低又間接反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。SOD是重要的過氧化物分解酶，能有效清除氧自由基從而抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并能穩(wěn)定細胞膜，SOD水平的高低間接反應(yīng)了機體抗氧化能力。Aghdassi等［6］報道，給予UC模型大鼠腹腔注射右旋糖苷鐵，可以加重其結(jié)腸損傷，加劇其粘膜氧化應(yīng)激狀態(tài)。

本研究中，F(xiàn)eSO4中、高劑量組給藥均可以惡化TN-BS造模導(dǎo)致大鼠的腹瀉、體質(zhì)量減輕等癥狀，加重UC模型大鼠結(jié)腸的組織學(xué)損傷，降低結(jié)腸組織及血清SOD的活力，升高結(jié)腸組織及血清MDA水平，對UC模型大鼠的氧化應(yīng)激狀態(tài)表現(xiàn)出明顯的加劇作用;但在給予正常大鼠同等劑量FeSO4時未見上述情況發(fā)生。

綜上所述，UC大鼠機體抗氧化能力減弱，處于氧化應(yīng)激狀態(tài);當(dāng)給予口服一定劑量FeSO4時，可能通過Fe2+作用產(chǎn)生大量氧自由基，導(dǎo)致機體的氧化應(yīng)激進一步惡化，從而加劇機體的氧化損傷。因此，對于UC合并貧血補鐵治療時，應(yīng)選擇正確的補鐵方式（如非離子鐵），合理的營養(yǎng)干預(yù)，提高機體抗氧化能力，對于預(yù)防口服補鐵引起的氧化應(yīng)激，減輕氧化損傷，減少并發(fā)癥的發(fā)生有重要意義。

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