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【摘要】在文獻(xiàn)檢索的基礎(chǔ)上，對(duì)近10年來(lái)在中藥作用機(jī)理中主要應(yīng)用的分子生物學(xué)技術(shù)——核酸分子雜交技術(shù)、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)、差異顯示PCR技術(shù)和DNA陣列技術(shù)的基本原理、應(yīng)用實(shí)例、優(yōu)勢(shì)與不足做了概述，并對(duì)未來(lái)的中藥機(jī)理研究技術(shù)、方向和前景做了展望。

【關(guān)鍵詞】分子生物學(xué)技術(shù)；中藥；作用機(jī)理

中藥自古以來(lái)就是我國(guó)人民防治疾病的主要武器，對(duì)中華民族的生存與繁衍起著不可忽視的作用，長(zhǎng)期的醫(yī)療實(shí)踐累積了寶貴而豐富的經(jīng)驗(yàn)，并與中醫(yī)學(xué)共同形成了一套完整獨(dú)特的理論體系。但如何用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)語(yǔ)言闡釋其作用機(jī)理，提供科學(xué)依據(jù)，使其廣為世界接受是一重大難題。近年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，不僅根本性地改變了生命科學(xué)的研究方式，也為中藥的作用機(jī)理研究提供了有力工具和良好的發(fā)展契機(jī)，使得中藥基因轉(zhuǎn)錄水平的機(jī)理研究成為可能。筆者對(duì)近10年來(lái)有關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)在中藥基因轉(zhuǎn)錄水平作用機(jī)理研究中的應(yīng)用綜述如下。

1核酸分子雜交技術(shù)

核酸分子雜交技術(shù)是分子生物學(xué)的基本技術(shù)之一，基本原理是具有一定同源性的2條核酸單鏈在一定的條件下按堿基互補(bǔ)原則退火形成雙鏈。雜交的雙方是待測(cè)核酸序列及探針。其中將核酸提取分離后在體外與探針雜交的是印跡雜交，直接在組織細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的是原位雜交。

中藥作用機(jī)理研究中較早常用的有RNA印跡雜交(Northernblot),點(diǎn)雜交（dotblot）和原位雜交。二仙湯是治療婦女更年期綜合征、抗衰老的名方，具溫補(bǔ)腎陽(yáng)、瀉相火、調(diào)沖任功能。廖柏松等［1］采用Northernblot對(duì)18月齡雌性大鼠下丘腦內(nèi)阿片肽的基因表達(dá)水平進(jìn)行研究，結(jié)果表明，二仙湯組β內(nèi)啡肽前體阿黑皮素原和腦啡肽原的mRNA水平明顯升高，達(dá)到未衰老前水平。沈小珩等［2］則從衰老過(guò)程抗氧化酶活性降低，且酶活性降低與其蛋白質(zhì)基因表達(dá)水平降低平行的現(xiàn)象出發(fā)，采用分子雜交等技術(shù)考察二仙湯及其拆方對(duì)超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶基因表達(dá)水平及其活性的影響。結(jié)果表明，抗氧化酶活性顯著升高，且與其mRNA表達(dá)水平升高呈平行關(guān)系,提示二仙湯抗衰老是通過(guò)增強(qiáng)抗氧化酶基因表達(dá)水平而實(shí)現(xiàn)的。海風(fēng)藤有祛風(fēng)除濕、通經(jīng)活絡(luò)的功效。韓恩吉等［3］采用Northernblot觀察它對(duì)人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系列淀粉樣前體蛋白(βamyloidprecursorprotein,βAPP)基因表達(dá)的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，海風(fēng)藤選擇性地抑制βAPP基因表達(dá),為其防治阿爾茨海默病提供了一定依據(jù)。鄭欽岳等［4］應(yīng)用dotblot研究了補(bǔ)血和血方四物湯對(duì)白細(xì)胞介素6（interleukin6，IL6）mRNA表達(dá)的影響，實(shí)驗(yàn)表明,四物湯在0.01～1.00ng/mL濃度內(nèi)可使IL6mRNA的表達(dá)明顯增加。保心丸具有降脂、降低血漿內(nèi)皮素、抑制血小板聚集等作用。為進(jìn)一步闡明保心丸抗實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化（artherosclerosis，AS）的機(jī)理,樊永平等［5］用原位雜交技術(shù)研究?jī)?nèi)皮素（endothelin，ET）和一氧化氮合酶(Nitricoxidesynthase,NOS)在AS家兔主動(dòng)脈壁的基因表達(dá)。結(jié)果證實(shí)，保心丸組ET1mRNA的表達(dá)較模型組低,而NOSmRNA較模型組高,提示保心丸調(diào)節(jié)血管內(nèi)源性NO和ET之間的平衡可能是其抗實(shí)驗(yàn)性AS的機(jī)理之一。精制血府膠囊是血府逐瘀湯的化裁精簡(jiǎn)方，其抗心肌缺血療效明顯優(yōu)于原方，為揭示其作用機(jī)制，證實(shí)其療效，王偉等［6，7］分別采用Northernblot和原位雜交等技術(shù)，研究其對(duì)于心肌缺血密切相關(guān)基因表達(dá)的影響，前者結(jié)果表明精制血府膠囊顯著提高缺血缺糖心肌細(xì)胞NOSmRNA表達(dá)水平，后者的精制血府膠囊組，ET1和內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶（endothelinconvertingenzyme，ECE）1的mRNA表達(dá)較其它組明顯減少，且心肌細(xì)胞損傷也較其它組顯著減輕。因而推測(cè)精制血府膠囊可能是通過(guò)提高NOS表達(dá)、促進(jìn)NO生成及抑制ET1、ECE1的基因表達(dá)，減少ET1生成，減輕其對(duì)心肌細(xì)胞的直接損傷，發(fā)揮保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。

Northernblot是用來(lái)測(cè)量真核生物RNA的量和大小及估計(jì)其豐度的實(shí)驗(yàn)方法，并可從大量RNA樣本中同時(shí)獲得這些信息，但需要大量的材料，受RNA降解影響大，敏感性低。dotblot的不足之處在于點(diǎn)于同一張膜上同樣的樣品雜交信號(hào)有時(shí)不穩(wěn)定，且一般要用純化的RNA樣品。原位雜交的優(yōu)勢(shì)在于可對(duì)組織細(xì)胞中的核酸進(jìn)行精確定位。核酸分子雜交是分子生物學(xué)基本技術(shù)，隨著反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RTPCR）技術(shù)、差異顯示PCR（differentialdisplayPCR，DDPCR）、DNA陣列等優(yōu)勢(shì)技術(shù)的出現(xiàn)、逐漸成熟而應(yīng)用漸增，近5年應(yīng)用基本的分子雜交技術(shù)研究中藥作用機(jī)理的報(bào)道已少見。

2RTPCR技術(shù)

PCR是美國(guó)科學(xué)家Mullis于1983年發(fā)明的一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，RTPCR是從RNA擴(kuò)增cDNA拷貝的方法，即先將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用PCR擴(kuò)增，使其敏感性大大提高，解決了dotblot或Northernblot中目的mRNA含量太低的問題，是目前中藥機(jī)理研究中最常用的分子生物學(xué)技術(shù)，從發(fā)表的文獻(xiàn)數(shù)量可以反映出來(lái)。

這方面的研究報(bào)道包括有Gumiganghwaltang(GMGHT)抗炎機(jī)制的研究，KIMSJ等［8］研究其在小鼠腹膜巨噬細(xì)胞中的抗炎機(jī)制，結(jié)果顯示，GMGHT以劑量依賴的方式降低了脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子α（tumornecrosisfactoralpha，TNFα）,IL6和環(huán)氧酶2mRNA表達(dá)水平，推測(cè)這是GMGHT減少炎癥的重要分子機(jī)制之一。為了闡釋二仙湯治療腎陽(yáng)虛證的作用機(jī)理，鄭小偉等［9］考察了二仙湯不同時(shí)間對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠垂體促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotrophichormone，ACTH)基因表達(dá)的影響。結(jié)果是二仙湯可以上調(diào)垂體組織ACTH基因表達(dá)，且表達(dá)量隨用藥時(shí)間延長(zhǎng)而增加，提示上調(diào)ACTHmRNA表達(dá)是二仙湯治療腎陽(yáng)虛證的作用機(jī)理之一。β地中海貧血是一種遺傳性溶血性貧血病，補(bǔ)腎生血方具有補(bǔ)腎、益髓、生血作用，用于治療雜合子患者療效明顯。為揭示其分子機(jī)理，吳志奎等［10］采用RTPCR等技術(shù)考察了用藥者的α、β和γ珠蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎生血膠囊能明顯提高β地中海貧血患者血紅蛋白（hemoglobin，Hb）和抗堿血紅蛋白（hemoglobinF），Hb珠蛋白鏈比增加，γ珠蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄水平相應(yīng)升高，說(shuō)明補(bǔ)腎生血藥具有促進(jìn)γ珠蛋白轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，誘導(dǎo)HbF合成作用，代償了β珠蛋白基因的缺陷。益髓生血顆粒是補(bǔ)腎生血方的顆粒劑，易杰等［11］研究了其對(duì)β地中海貧血患者造血刺激因子干細(xì)胞因子（Stemcellfactor，SCF）及人紅細(xì)胞生成素受體（erythropoietinreceptor，EPOR）mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，治療后,外周血EPOR、SCFmRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，因此推測(cè)益髓生血顆?？赡苁峭ㄟ^(guò)影響SCF以及EPORmBNA表達(dá)來(lái)促進(jìn)骨髓造血,提高Hb、紅細(xì)胞的水平,達(dá)到治療β地中海貧血的目的。陳智松等［12-14］從此方的抗衰老及中醫(yī)腎生髓理論的角度出發(fā)，分別研究其對(duì)骨髓有核細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、促使機(jī)體衰老的原癌基因cmyc、抑制細(xì)胞凋亡的原癌基因Bcl2和造血刺激因子粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocytemacrophagecolonystimutaingfactor，GMCSF)基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明，衰老時(shí)高表達(dá)的骨髓cmyc，明顯降低的Bcl2和GMCSF，用藥后，前者表達(dá)水平明顯下降甚至不表達(dá)，后兩者表達(dá)明顯提高。因此認(rèn)為補(bǔ)腎生血方通過(guò)抑制cmyc的表達(dá)，促進(jìn)Bcl2表達(dá)，從而抑制骨髓細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，延緩了衰老，并結(jié)合有關(guān)的醫(yī)學(xué)成果，認(rèn)為Bcl2和GMCSF是腎生髓的本質(zhì)相關(guān)基因。凌云彪等［15］研究清熱活血補(bǔ)益方(肝纖方)對(duì)大鼠肝臟Ⅰ型前膠原mRNA的表達(dá)和膠原酶活性的影響。結(jié)果表明,以清熱活血補(bǔ)益方制備的含藥血清抑制了Ⅰ型前膠原mRNA的表達(dá)，膠原酶的活性增加。提示此方抑制Ⅰ型前膠原mRNA的表達(dá),減少膠原的合成,同時(shí)提高膠原酶的活性促進(jìn)膠原的降解,可能是其抗肝纖維化的部分機(jī)制。此外，蔡晶等［16］通過(guò)檢測(cè)雌激素受體(estrogenreceptor，ER)α和βmRNA表達(dá)量，考察了補(bǔ)腎陽(yáng)中藥淫羊藿和補(bǔ)腎陰中藥女貞子對(duì)雄性大鼠杏仁核和皮質(zhì)頂葉ERmRNA的調(diào)節(jié)表達(dá)差異,結(jié)果顯示，兩用藥組大鼠杏仁核、皮質(zhì)頂葉ERαmRNA表達(dá)量無(wú)明顯變化,ERβmRNA表達(dá)量都上調(diào)，且淫羊藿組高于女貞子組，說(shuō)明補(bǔ)腎中藥可能是通過(guò)對(duì)ERβ的調(diào)節(jié)來(lái)發(fā)揮作用。

RTPCR的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)在于RNA純度不必很高，僅少量RNA模板即能滿足實(shí)驗(yàn)所需，盡管實(shí)踐中RTPCR還遠(yuǎn)達(dá)不到理論上能檢測(cè)到單一拷貝的RNA樣品的敏感度，但遠(yuǎn)高于Northernblot。尤其適用于可獲得的mRNA數(shù)量有限和目的基因表達(dá)水平很低時(shí)測(cè)定基因表達(dá)的強(qiáng)度。只是擴(kuò)增步驟中樣品間擴(kuò)增效率的微小差異將極大地影響信號(hào)強(qiáng)度，使用內(nèi)參照可以減少這一問題，但無(wú)法徹底排除［17］?？偟膩?lái)說(shuō)，RTPCR是測(cè)量RNA樣品中低豐度mRNA時(shí)的最佳方法。

3DDPCR技術(shù)

1992年，梁鵬等建立了一種對(duì)不同來(lái)源的mRNA樣品用PCR技術(shù)對(duì)其中許多的cDNA基因一起進(jìn)行擴(kuò)增和顯示的實(shí)驗(yàn)方法，即DDPCR。該方法依賴2套不同類型的合成寡核苷酸引物：一套錨定反義引物與一套隨機(jī)正義引物。最后通過(guò)比較不同來(lái)源的擴(kuò)增cDNA產(chǎn)物的電泳帶譜，能夠發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的基因。

中藥作用機(jī)理研究中應(yīng)用DDPCR的報(bào)道有唐發(fā)清等［18］對(duì)有抗鼻咽癌作用的益氣解毒片干預(yù)鼻咽癌細(xì)胞基因表達(dá)的研究，旨在從基因選擇性表達(dá)水平探討其抗鼻咽癌的機(jī)理。結(jié)果表明,益氣解毒片在體外能抑制鼻咽癌細(xì)胞基因的表達(dá),同時(shí)誘導(dǎo)一些特異基因的表達(dá),從而抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖。

相比以往的方法，DDPCR技術(shù)提供了幾方面理論上的優(yōu)勢(shì)，如理論上能夠靈敏地檢測(cè)組織或細(xì)胞中表達(dá)量極低的mRNA樣品的差異表達(dá)，能鑒別特定組織或細(xì)胞來(lái)源樣品之間轉(zhuǎn)錄水平的mRNA定性和定量變化。這種優(yōu)勢(shì)同樣可體現(xiàn)在中藥機(jī)理研究中，可同時(shí)顯示中藥作用后對(duì)多種基因轉(zhuǎn)錄的不同影響，將有影響的靶基因條帶回收，再擴(kuò)增、克隆、測(cè)序，查詢確定是什么基因，是已知或未知序列，這樣就可以確定中藥起效可能源于影響那些基因轉(zhuǎn)錄。但這些優(yōu)勢(shì)目前部分還停留在理論上，還有許多技術(shù)問題有待解決，如經(jīng)DDPCR鑒定出來(lái)的超過(guò)半數(shù)的cDNA是假陽(yáng)性條帶，靶細(xì)胞的總mRNA中的一部分不能被高水平擴(kuò)增、造成丟失等［17］。盡管目前DDPCR應(yīng)用在中藥基因轉(zhuǎn)錄水平的機(jī)理研究報(bào)道還很少，但毋庸置疑，其潛力巨大。

4DNA陣列技術(shù)

DNA陣列技術(shù)是新發(fā)展起來(lái)的可同時(shí)分析數(shù)千個(gè)基因表達(dá)譜的技術(shù)。其原理同核酸分子雜交。在不同的文獻(xiàn)中的稱謂不盡相同，如基因芯片、DNA芯片、微陣列等，目前沒有明確區(qū)分，通?；煊?。

目前有零散的采用商用或自制微陣列研究中藥基因表達(dá)水平的報(bào)道。如周聯(lián)等［19］采用含2048個(gè)基因的小鼠基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)黃連解毒湯及其成分黃芩苷和鹽酸小檗堿對(duì)LPS造型的小鼠脾細(xì)胞基因表達(dá)的影響，結(jié)果復(fù)方的作用明顯優(yōu)于有效成分的作用，但對(duì)具體基因表達(dá)影響的分析存在一定難度。王廣良等［20］用自制的包含24個(gè)細(xì)胞周期相關(guān)基因的cDNA微陣列，對(duì)抑制肝癌細(xì)胞增殖的4種中藥烏藥、青蒿、紫草和黃芪的抗腫瘤分子機(jī)制研究表明，4種中藥對(duì)細(xì)胞周期基因和損傷檢測(cè)點(diǎn)基因均有不同程度改變,表現(xiàn)為部分上調(diào),部分下調(diào),通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了用其治療癌癥的合理性。

在中藥作用機(jī)理研究中，DNA陣列技術(shù)可以同時(shí)對(duì)使用中藥前后的數(shù)千個(gè)基因表達(dá)情況進(jìn)行比較和差異分析；且具有所需樣品的用量極少、自動(dòng)化程度高、被測(cè)目標(biāo)DNA密度高的優(yōu)點(diǎn)。但目前微陣列技術(shù)也存在許多問題，如其小型化和高通量的特點(diǎn)使得對(duì)外界和內(nèi)部的變動(dòng)都很敏感，因此宜采用取平均值并標(biāo)準(zhǔn)化操作的辦法，但目前尚無(wú)普遍認(rèn)可的規(guī)則和標(biāo)準(zhǔn)來(lái)指導(dǎo)微陣列實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)采集和分析方法及操作系統(tǒng)也存在很大不同［17］。此外，基因表達(dá)與調(diào)控研究的滯后，使得中藥機(jī)理研究中獲得的很多信息難于解釋；昂貴的制作費(fèi)用也是一個(gè)限制因素。

5展望

總體來(lái)講，中藥的作用機(jī)理研究應(yīng)是多水平的，不僅包括基因轉(zhuǎn)錄水平，也包括轉(zhuǎn)錄后、蛋白質(zhì)翻譯及翻譯后水平的調(diào)控上，對(duì)每個(gè)特定的中藥/中藥復(fù)方，可能不一定在各水平上都有影響，基因轉(zhuǎn)錄水平的機(jī)理研究主要就是考察對(duì)相關(guān)靶基因mRNA水平的改變，也是目前分子生物學(xué)技術(shù)在中藥機(jī)理研究中的主要應(yīng)用范疇。中藥尤其是中藥復(fù)方的多成分多功效決定了其很可能對(duì)基因轉(zhuǎn)錄水平有影響，已完成的研究結(jié)果已證明了這一點(diǎn)。

中藥的機(jī)理研究通過(guò)應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)已深入到幾乎是最根本的基因轉(zhuǎn)錄水平，并在該水平上對(duì)中藥的療效獲得了一定解釋，但整體上還處于探索階段。已有的研究主要是應(yīng)用如核酸分子雜交、RTPCR技術(shù)等考察“單基因”的技術(shù)，應(yīng)用如DDPCR、DNA陣列等研究多基因的技術(shù)的報(bào)道較少。中藥調(diào)節(jié)機(jī)體平衡的特點(diǎn)決定了對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的影響很可能是對(duì)多基因的協(xié)同影響，如對(duì)補(bǔ)腎生血方的系列研究已表明此方的功效與影響EPOR、SCF、cmyc、Bcl2、GMCSF基因表達(dá)有關(guān)。因此，應(yīng)用研究多基因表達(dá)的技術(shù)考察對(duì)多基因的協(xié)同影響將是未來(lái)中藥基因轉(zhuǎn)錄水平作用機(jī)理研究的主要方向。相信隨著現(xiàn)有技術(shù)的不斷發(fā)展和完善、新技術(shù)的出現(xiàn)及多種技術(shù)相結(jié)合加上疾病細(xì)胞分子水平研究的深入，復(fù)雜的中藥作用機(jī)理會(huì)逐步得到闡釋，中藥的療效和可能發(fā)現(xiàn)的新功效將從機(jī)理上獲得科學(xué)依據(jù)，為中藥獲得像西藥一樣的市場(chǎng)準(zhǔn)入權(quán)提供有力的支撐。

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