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本文作者：孟慶國(guó)1陳靜1黃艷青2靳明建3顧偉1王文1作者單位：1南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所

材料與方法

1實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康紅螯螯蝦購(gòu)自南京某養(yǎng)殖場(chǎng)，體重10～20g，于室內(nèi)水循環(huán)系統(tǒng)中暫養(yǎng)(通氣、換水)，水溫24～26℃，每天投喂飼料。實(shí)驗(yàn)試劑:Trizol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品;普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和pMD－18T載體等均為TaKaRa公司產(chǎn)品;SMARTTMcDNAlibraryconstructionkit和SMARTTMRACEcDNAAm-plificationKit購(gòu)自Clontech公司，其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。大腸桿菌DH5由本實(shí)驗(yàn)室保存。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

2總RNA提取和cDNA文庫(kù)構(gòu)建

2mL一次性注射器抽取紅螯螯蝦血淋巴，迅速與等量的抗凝劑混合(葡萄糖05g;檸檬酸0.8g;氯化鈉0.42g;雙蒸水定容至100mL)，2000g、4℃離心樣品10min以收集血淋巴細(xì)胞。參照Trizol試劑操作提取總RNA，測(cè)定RNA的濃度和純度，2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性。按照SMARTTMcDNAlibraryconstructionkit說(shuō)明書(shū)構(gòu)建紅螯螯蝦血淋巴細(xì)胞cDNA文庫(kù)。合成雙鏈的cDNA連接到pMD－18T載體中，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性克隆后送華大公司測(cè)序。測(cè)序得到序列經(jīng)BLAST比對(duì)后得到紅螯螯蝦的冷休克YB基因的部分序列。

3RACE及全長(zhǎng)序列的獲得

根據(jù)已經(jīng)得到的冷休克YB基因的部分序列設(shè)計(jì)5''''和3''''RACE引物(表1)。在進(jìn)行5''''和3''''RACE反轉(zhuǎn)錄時(shí)，YB5R和NUP引物用于擴(kuò)增5''''端，YB3F和NUP引物用于擴(kuò)增3''''端。RACE步驟按照SMARTTMRACEcDNAAmplificationKit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。擴(kuò)增得到的片段純化并連接入載體后送華大公司測(cè)序。根據(jù)已獲得的全部cDN段，設(shè)計(jì)引物YB－ORF－F和YB－ORF－R擴(kuò)增YB基因的開(kāi)放讀碼框。

4序列分析

在NCBI網(wǎng)站，進(jìn)行相似性搜索，下載其他物種冷休克Y－box蛋白的序列。通過(guò)ORFFinder找到紅螯螯蝦冷休克Y－boxcDNA序列的開(kāi)放讀碼框，并推導(dǎo)出其氨基酸序列，用ComputepI/Mw和Interproscan等工具分別預(yù)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)和功能域，用ClustalW同源性分析，用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，冷休克Y－box蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)用SWISS－MODEL。

5Real－timePCR分析

使用Trizol分別提取3尾紅螯螯蝦肝臟、腸、鰓、心臟、血淋巴、神經(jīng)和肌肉總RNA，以O(shè)ligodT和隨機(jī)引物合成cDNA第一鏈，根據(jù)已獲得的紅螯螯蝦的冷休克YB基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物YB－RT－F和YB－RT－R，同時(shí)以紅螯螯蝦β－actin基因序列(GenBank:AY430093)為內(nèi)參設(shè)計(jì)引物β－actin－F和β－actin－R，對(duì)各組織冷休克YB基因的表達(dá)進(jìn)行定量分析，擴(kuò)增條件同為94℃預(yù)變性30s后，94℃5s、60℃30s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行溶解曲線分析，以確保特異性擴(kuò)增。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，以未加模板的PCR反應(yīng)樣品作為陰性對(duì)照。不同組織中的冷休克YB基因相對(duì)表達(dá)水平用2－△△CT方法(△△Ct=(Ct目的基因－Ct管家基因)實(shí)驗(yàn)組－(Ct目的基因－Ct管家基因)對(duì)照)進(jìn)行計(jì)算，數(shù)據(jù)分析采用t測(cè)驗(yàn)方法(SPSS軟件)，當(dāng)P＜0.05時(shí)被判定為差異顯著。

結(jié)果

1紅螯螯蝦冷休克Y－box蛋白基因的克隆和氨基酸序列分析

紅螯螯蝦的冷休克YB基因全長(zhǎng)cDNA由1733bp組成，其編碼區(qū)有975bp，編碼324個(gè)氨基酸。在起始密碼子ATG的上游有82bp非翻譯區(qū)，終止密碼子TAA的下游有包含polyA在內(nèi)的676bp非編碼區(qū)序列(圖1A)。紅螯螯蝦冷休克Y－box蛋白的預(yù)測(cè)等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量分別為9.81和35800。

2紅螯螯蝦冷休克Y－box蛋白氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過(guò)序列比對(duì)和相似性分析，紅螯螯蝦冷休克與其他物種的冷休克Y－box蛋白有一定的相似性，特別是在前部(20－98AA，冷休克結(jié)構(gòu)域)具有非常高的相似性，此部分為此類蛋白重要的功能域(冷休克蛋白保守位點(diǎn)和核酸集合功能域)(圖2)，而其他部分(富含丙氨酸或脯氨酸的區(qū)域、帶電荷區(qū)域，圖1B)的相似性較低。通過(guò)ClustalW軟件分析和MEGA軟件構(gòu)建冷休克Y－box蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，紅螯螯蝦冷休克Y－box蛋白與水蚤的冷休克Y－box蛋白進(jìn)化關(guān)系最近，并與昆蟲(chóng)等其他節(jié)肢動(dòng)物冷休克Y－box蛋白聚為一支(圖3A)，而與脊椎動(dòng)物冷休克Y－box蛋白序列(同樣聚為一支)進(jìn)化關(guān)系相距較遠(yuǎn)。應(yīng)用SWISS－MODEL預(yù)測(cè)了紅螯螯蝦冷休克Y－box蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，并與D.pulex冷休克Y－box蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)它們的結(jié)構(gòu)非常相似(圖3B和C)。

3紅螯螯蝦冷休克Y－box蛋白基因的組織表達(dá)分析

使用Realtime－RT－PCR方法對(duì)紅螯螯蝦冷休克Y－box蛋白基因在各組織中的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，冷休克Y－box蛋白基因轉(zhuǎn)錄活性最強(qiáng)的組織是神經(jīng)，而后依次為肝臟、血淋巴和鰓，在腸和心臟中也有活性，在肌肉組織中轉(zhuǎn)錄保持較低水平(圖4)。

討論

本研究克隆的紅螯螯蝦冷休克Y－box蛋白基因cDNA開(kāi)放讀碼框?yàn)?75bp，推測(cè)的蛋白質(zhì)324個(gè)氨基酸。與其他冷休克Y－box蛋白一樣，紅螯螯蝦冷休克Y－box蛋白也由三部分結(jié)構(gòu)域組成(富含丙氨酸或脯氨酸的區(qū)域、冷休克結(jié)構(gòu)域和帶電荷區(qū)域)，其中20－98AA為冷休克結(jié)構(gòu)域，此部分具有很高的保守性，與脊椎動(dòng)物(哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類、魚(yú)類等)和其他無(wú)脊椎動(dòng)物(軟體動(dòng)物、昆蟲(chóng)等)的相似性都在80%以上。因此，作為第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的經(jīng)濟(jì)水生甲殼動(dòng)物的冷休克Y－box蛋白，其具有與其他動(dòng)物冷休克Y－box蛋白相似的特征。通過(guò)冷休克Y－box蛋白氨基酸序列遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)紅螯螯蝦與另外一個(gè)甲殼動(dòng)物———水蚤的進(jìn)化關(guān)系最近，且與昆蟲(chóng)等節(jié)肢動(dòng)物聚為一支，而其他脊椎動(dòng)物、軟體動(dòng)物等聚為一支，這也基本上與傳統(tǒng)的動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)生分類次序吻合。本研究還預(yù)測(cè)了紅螯螯蝦冷休克Y－box蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其三級(jí)結(jié)構(gòu)與其他動(dòng)物冷休克Y－box蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)非常相似，特別是冷休克結(jié)構(gòu)域部分都是由六個(gè)相同的β－折疊組成，只是在蛋白的N端有一部分結(jié)構(gòu)有差別。由于目前發(fā)現(xiàn)的冷休克Y－box蛋白較少，且報(bào)道的相關(guān)研究對(duì)象都是人、鼠等模式動(dòng)物。而本研究中發(fā)現(xiàn)的冷休克Y－box蛋白來(lái)源于甲殼動(dòng)物。無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物在器官分類上有較大的差別，加之有關(guān)無(wú)脊椎動(dòng)物冷休克Y－box蛋白基因組織分布也未見(jiàn)報(bào)道，所以目前只能對(duì)不同的動(dòng)物種類冷休克Y－box蛋白基因的組織分布做直觀描述，無(wú)法進(jìn)行不同物種之間相關(guān)信息的對(duì)比。研究了紅螯螯蝦冷休克Y－box蛋白在不同組織中的分布，發(fā)現(xiàn)紅螯螯蝦冷休克Y－box蛋白基因轉(zhuǎn)錄活性最強(qiáng)的組織是神經(jīng)，這可能與在對(duì)冷刺激敏感相關(guān)，也可能與神經(jīng)在信號(hào)傳導(dǎo)和內(nèi)分泌調(diào)劑中的重要作用相關(guān)［18－20］，紅螯螯蝦冷休克Y－box蛋白基因在心、腸和肌肉中的表達(dá)量很低。在非洲爪蟾中，卵巢和睪丸中冷休克Y－box蛋白基因轉(zhuǎn)錄活性最強(qiáng)，而后依次是輸卵管、腎、心、肝和皮膚［21］。在小鼠中也是睪丸中冷休克Y－box蛋白基因轉(zhuǎn)錄活性最高，而后其次是肌肉、腎、脾、心和卵巢，肝和血中幾乎沒(méi)有表達(dá)［18］，還有人發(fā)現(xiàn)小鼠冷休克Y－box蛋白基因轉(zhuǎn)錄活性的順序?yàn)椴G丸、腎、心、脾、肌肉、肝和腦［22］，以上證明冷休克Y－box蛋白在動(dòng)物睪丸中表達(dá)最高，表明其在精子發(fā)育中起到非常重要的作用［18，21－22］。由此看出冷休克Y－box蛋白基因在不同動(dòng)物心和肌肉中的表達(dá)量均較低，而在與內(nèi)分泌相關(guān)的組織如卵巢、睪丸等中表達(dá)量較高。然而，此前關(guān)于Y－box蛋白在其他動(dòng)物組織中的分布情況研究都沒(méi)有涉及神經(jīng)組織，所以本研究為其他動(dòng)物Y－box蛋白在組織中的分布研究提供了新的思路，即除了關(guān)注肌肉、腎、脾、心、肝和生殖系統(tǒng)的組織外還需要關(guān)注神經(jīng)組織，也許神經(jīng)組織在這些動(dòng)物中也是Y－box蛋白的高表達(dá)區(qū)，而與神經(jīng)相關(guān)聯(lián)的內(nèi)分泌系統(tǒng)可能在參與冷休克蛋白的功能表達(dá)和信息傳遞中起重要作用。本研究首次克隆的到了紅螯螯蝦冷休克Y－box蛋白基因，對(duì)其組織表達(dá)進(jìn)行了研究，并發(fā)現(xiàn)該蛋白在神經(jīng)中的高表達(dá)現(xiàn)象，為下一步深入開(kāi)展該蛋白的功能及其與其相關(guān)的生理調(diào)節(jié)機(jī)能研究奠定了基礎(chǔ)。