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本文作者：王建國1,2許琴瑟1王權1熊良偉1陸宏達1封琦1朱云干1作者單位：1江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術學院2上海海洋大學水產與生命學院

試驗結果

1溫度對酚氧化酶活力的影響

不同溫度下克氏原螯蝦鰓組織po活力變化如圖1，血清PO活力變化如圖2。鰓組織PO活力大于血清PO，不同溫度下鰓組織和血清PO活力變化規(guī)律很相似。0～35℃內PO活力均隨溫度上升逐漸增大，各溫度組鰓組織PO活力均存在顯著差異(P＜0.05)，其中血清PO活力除20℃與25℃和25℃與30℃無顯著差異外，其余各組間均有顯著性差異(P＜0.05)。35～45℃之間PO活力逐漸下降，但尚未達到顯著差異水平(P＞0.05)。當溫度高于45℃時PO活力急劇下降，各組間存在顯著差異(P＜0.05)。溫度低于35℃時樣品對照組引起的吸光度值較小，高于40℃時吸光度迅速增大，影響測定結果。0℃冰水浴中PO仍具有一定活力，約為25℃時的31%，35℃時的24%。溫度低于35℃時底物對照組引起吸光度變化較小，35℃以上隨溫度升高吸光度逐漸升高，40℃開始吸光度顯著高于35℃以下溫度組(P＜0.05)，65℃時吸光度最高，為35℃時的16倍。說明溫度過高時底物引起的吸光度變化會干擾PO測定。

2緩沖液pH對酚氧化酶活力的影響

在不同pH環(huán)境中鰓組織中PO活力變化如圖3。鰓組織中PO在pH5.5時活力最高，除與pH6無顯著差異外(P＞0.05)，均顯著高于其它組(P＜0.05);pH6時與pH7～10各組間均存在顯著性差異(P＜0.05)。PO具活力的pH范圍為4～9.5，最適pH為5.5～6。結果顯示偏酸性緩沖液中PO活力較高。不同pH環(huán)境中血清中PO活力變化如圖4。血清中PO活力在pH6.5時最高，顯著高于其它組(P＜0.05)。具活力的pH范圍為5.5～8.5，pH為5.5～6和7～8各組間無顯著性差異(P＞0.05)，pH低于5和高于9時活力迅速下降。pH5以下時樣品引起吸光度變化較大，pH越低吸光度變化越明顯;pH8.5以上時底物L-DOPA會生成紅棕色物質，pH越大越明顯，對測定干擾較大。以上結果說明pH對血清PO和鰓組織PO的影響存在一定差異。

討論

1溫度對酚氧化酶活力的影響

日本對蝦［10］、日本［11］等酚氧化酶與L-DOPA反應的最適溫度為40℃，白對蝦和斑節(jié)對蝦［12］最適溫度為45℃，南美白對蝦［13］最適溫度為50℃，中國對蝦［5］最適溫度為55℃，龍蝦［14］的最適溫度為30℃，鋸緣青蟹［15］最適溫度為25℃，朱毅菲等［7］報道克氏原螯蝦最適溫度為20℃。從以上數(shù)據(jù)可以看出甲殼動物種類不同其PO最適溫度具有較大差異，在20～55℃之間不等，因此在進行PO活力測定中根據(jù)品種選用合適的溫度條件是非常必要的。在本實驗設計的溫度范圍(0～75℃)內，克氏原螯蝦血清和鰓組織中PO的最適溫度均為35℃，朱毅菲等［7］的實驗結果中溫度從20～50℃PO活力是呈下降趨勢，最適溫度為20℃，這兩個結果差異很大。但其未設置溫度低于20℃的情況，70淡水漁業(yè)2012年在20℃以下PO活力不清楚的情況下判斷最適溫度為20℃是不嚴密的。本實驗所采用的克氏原螯蝦也是暫養(yǎng)在20℃左右，與朱毅菲等的實驗結果差異較大。朱毅菲等［7］認為克氏原螯蝦血清PO活力在20℃最高的原因是實驗用蝦處于22℃的水中已適應了此溫度環(huán)境，在越接近其生活環(huán)境的溫度下酶活力越高，反應越徹底;而反應溫度與螯蝦環(huán)境溫度差異越大，對酚氧化酶造成的破壞越大。日本沼蝦［4］、日本對蝦［10］、南美白對蝦［13］、中國對蝦［5］等多種甲殼動物PO最適溫度都高于其生活溫度，克氏原螯蝦適應能力極強，在10～30℃能正常生長發(fā)育，因而僅以適應了實驗溫度解釋其最適溫度是不可取的。另外朱毅菲等［7］的結果顯示當溫度達到50℃以上時PO活力會出現(xiàn)升高的現(xiàn)象，其實不是活力真正升高，而是因為當溫度升高時樣品和底物均會產生較大吸光度所致(如圖1，2)，所以如果沒有設置空白對照扣除這部分差值就會得出50℃以上活力反而升高的結果，因此朱毅菲等［7］計算PO活力的方法也存在不妥之處。筆者認為本實驗所得出的克氏原螯蝦酚氧化酶最適溫度為35℃可靠性更高，而朱毅菲等通過試驗得出最適溫度為20℃的結果是不夠準確的，一方面可能是由于試驗本身造成，另一方面可能和所選實驗對象的生活環(huán)境及地區(qū)差異等有關造成。本實驗還測定了冰水混合物(0℃)時鰓組織和血清中PO的活力均為最高值的24%左右。許多學者在測定PO活力時均借鑒其他酶活力的測定工藝，使底物與樣品反應一段時間后采用冰浴法來終止反應［5-6］，這在克氏原螯蝦PO活力的測定中是有不妥之處的。冰浴只能在一定程度上減緩反應速度，無法達到和其他酶同等的效果，因此該方法的使用有待學者斟酌。

2緩沖液pH值對酚氧化酶活力的影響

動物體液的pH因種類不同而有一定差異，不同甲殼動物PO最適pH也不完全相同。汪小鋒等［16］報道中國對蝦最適pH為6.0，楊玲玲等［11］報道日本最適pH為6.0，夏棟等［14］報道龍蝦最適pH為6.3，趙丙辰等［13］報道南美白對蝦最適pH為6.0，而陳麗嬌等［17］報道南美白對蝦最適pH為7.0，趙嬌等［10］報道日本對蝦最適pH為6.5，陸宏達等［8］報道中華絨螯蟹最適pH為6.5，潘清清等［15］報道鋸緣青蟹最適pH為7.8，以上報道的經濟甲殼類PO最適pH大多在6～8之間，一些昆蟲PO最適pH在5.0～9.5。本試驗結果顯示克氏原螯蝦鰓組織PO最適pH為5.5，血清PO最適pH為6.5，與朱毅菲等［7］報道的血清酚氧化酶最適pH為7.0的結果基本相似?？耸显r和大部分甲殼動物相似，在偏酸性的環(huán)境中PO活力相對較高。有學者認為偏酸性的環(huán)境會影響一些生物的PO活力［18］，和許多甲殼動物的研究結果不同，所以不同物種的PO特性具有較大差異。本實驗得出的最適pH和朱毅菲等［7］的結果略有差異，趙丙辰和陳麗嬌報道的南美白對蝦最適pH也存在一定差異，說明不同的生活環(huán)境及物種地區(qū)差異對PO特性也可能有影響。本實驗得出鰓組織PO活力的最佳pH為5.5，血清為6.5，具有一定差異;鰓組織PO活力大于血清PO與其他實驗中呈現(xiàn)的結果相似［8］，這說明同一物種體內不同部位的酚氧化酶不完全相同。甲殼動物PO的最適溫度、pH及激活劑、抑制劑等生化性質存在差異，其酚氧化酶基因也有一定差異，但都具有將酚氧化成醌的共同性質［19］，所以PO生化特性受物種差異影響較大，不同物種和不同組織都不能一概而論，具體差異還有待更多學者深入探討。Pind等［20］報道在測定PO時要盡量中和環(huán)境中多余的OH－以減少其和底物L-DOPA發(fā)生反應引起吸光度造成測量誤差。本實驗顯示樣品在pH值5～8.5的緩沖液中吸光度變化不大，L-DOPA在酸性和中性緩沖液中較穩(wěn)定，當pH超過8.5時溶液會生成黃棕色物質，出現(xiàn)較大吸光值，pH值越大引起吸光度變化也越大，會干擾測定。因此在PO活性測定中需要設置底物和樣品對照，才能使結果更加準確。