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本文作者：李莉莉王復(fù)興王義鵬秦松作者單位：中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所

菊芋是一種多年生草本植物，俗稱洋姜、鬼子姜。菊芋抗鹽、旱、寒等能力使它具有較強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)能力，可以在荒山野嶺、鹽堿灘涂等非耕地種植的特性使其成為一種極具開發(fā)潛力的半野生資源。菊芋生物量極大，地下塊莖每公頃高達(dá)90t[1]。同時(shí)塊莖干物質(zhì)中70%以上都是菊粉，該多聚果糖可以在酶的作用下分解而產(chǎn)生大量的果糖和少量的葡萄糖，為生物基化學(xué)品的生產(chǎn)提供了良好的碳源。此外，菊芋塊莖除含菊粉外，還含有一定數(shù)量的蛋白質(zhì)、脂肪、纖維素、果膠及微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分[2]，這些物質(zhì)的存在不但使菊芋塊莖具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，也為其在工業(yè)應(yīng)用中提供了養(yǎng)分。相比于咸菜腌制及動(dòng)物飼料等低附加值的應(yīng)用，作為能源作物的菊芋，能夠被微生物發(fā)酵得到高附加值的生物基化學(xué)品如燃料乙醇、丁酸等的各類生物基化學(xué)品[3-6]。而菊芋發(fā)酵過程中總糖含量的測(cè)定對(duì)發(fā)酵過程的評(píng)價(jià)具有重要的意義。建立菊芋發(fā)酵過程中總糖的測(cè)定方法是監(jiān)控菊芋發(fā)酵過程的必要步驟之一，同時(shí)發(fā)酵過程中的主要代謝物可能對(duì)糖類的測(cè)定有一定的影響。本實(shí)驗(yàn)首先建立了一種穩(wěn)定的總糖測(cè)定方法，其次考察了乙醇、丁酸、乳酸、1,4-丁二醇等代謝物對(duì)總糖測(cè)定的影響。

1材料與方法

1.1材料與儀器

硫酸、蒽酮、硫脲、乙醇、丁酸、乳酸、1,4-丁二醇、葡萄糖：AR級(jí)；菊粉wedin-P97：菊粉含量≥97，青海威德生物技術(shù)有限公司。TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；CP214電子天平：奧豪斯儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1溶液的配制

配制0.1g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和0.1g/L的菊粉標(biāo)準(zhǔn)液。

1.2.2糖-蒽酮反應(yīng)及吸光度的測(cè)定

將待測(cè)樣品放于具塞試管后，將具塞管置于冰浴中，加入蒽酮溶液4mL，混勻，沸水浴加熱反應(yīng)(反應(yīng)時(shí)間為后面結(jié)果得到的最佳反應(yīng)時(shí)間12min)，流水冷卻，室溫放置10min，用紫外分光光度計(jì)于最大吸收波長(zhǎng)處(620nm)測(cè)定吸光度。每個(gè)樣品均為3個(gè)平行樣，吸光度為3個(gè)樣品的平均值。

1.2.3最大吸收波長(zhǎng)的選擇

取1mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于具塞管中。蒽酮反應(yīng)后用紫外分光光度計(jì)于450~800nm進(jìn)行吸光度的掃描。

1.2.4總糖-蒽酮反應(yīng)時(shí)間的確定

取1mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于具塞管中。其中沸水浴的反應(yīng)時(shí)間選擇為3、5、7、8、10、12、14min。

1.2.5葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于具塞管中，分別用移液器補(bǔ)水至1mL。

1.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取0.5mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于具塞管中，用移液器補(bǔ)水至1mL。與蒽酮反應(yīng)完畢，流水冷卻放置0、0.25、1.25、2.25、2.75、3.25、3.75h時(shí)分別測(cè)定吸光度。

1.2.7回收率實(shí)驗(yàn)

取0.25mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和0.25mL菊粉標(biāo)準(zhǔn)液于具塞管中，分別用移液器補(bǔ)水至1mL；對(duì)照樣加蒸餾水1mL。1.2.8乙醇、丁酸、乳酸、1,4-丁二醇對(duì)總糖測(cè)定的影響配置含乙醇(或丁酸、乳酸、1,4-丁二醇)0、2%、6%、10%(v/v)的0.05g/L的菊粉溶液，取1mL放于具塞試管中。每個(gè)樣品重復(fù)3管。配制含乳酸(或1,4-丁二醇)0、2%、6%、10%(v/v)的溶液，取1mL放于具塞試管中。每個(gè)樣品重復(fù)3管。

2結(jié)果與討論

2.1最大吸收波長(zhǎng)的選擇

用分光光度計(jì)在450~800nm波長(zhǎng)下對(duì)菊粉溶液進(jìn)行掃描，由圖1可知，菊粉最大吸收波長(zhǎng)為620nm。本最大吸收波長(zhǎng)與以前報(bào)道的波長(zhǎng)是一致的[7]，說明本物質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)是非常穩(wěn)定的，總糖測(cè)定波長(zhǎng)選擇620nm。

2.2糖與蒽酮反應(yīng)時(shí)間的確定

對(duì)糖-蒽酮的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行考察發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)時(shí)間3、5、7、8、10、12min時(shí)吸光度逐漸增加(圖2)，而反應(yīng)12min時(shí)吸光度開始降低，故選擇12min作為兩者的最佳反應(yīng)時(shí)間。反應(yīng)容器及反應(yīng)體積的差異會(huì)導(dǎo)致最佳反應(yīng)時(shí)間的差異，總糖測(cè)定之前需要依照本身的實(shí)驗(yàn)容器和體系確定最佳反應(yīng)時(shí)間。

2.3葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：A=0.0278x-0.0047(其中x為葡萄糖濃度μg/mL)，回歸系數(shù)：R2=0.9998，在0~20μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可用于糖含量的測(cè)定。

2.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

分別在0、0.25、1.25、2.25、2.75、3.25、3.75h于621nm處測(cè)樣品的吸光度。結(jié)果顯示RSD為1.80%，表明在3.75h內(nèi)吸光度無(wú)明顯變化，顯色穩(wěn)定。

2.5回收率實(shí)驗(yàn)

在已知含量的菊粉樣品中分別加入一定量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率，其平均值為100.2%，RSD=4.25%。

2.6乙醇、丁酸對(duì)糖類測(cè)定的影響

由表1可知，含乙醇2%~10%的菊粉溶液與不含乙醇的菊粉對(duì)照樣相比吸光度變化不大，同時(shí)表2的t檢驗(yàn)結(jié)果顯示P值均大于0.05，含乙醇的菊粉液與無(wú)乙醇的對(duì)照樣相比吸光度無(wú)顯著性差異，結(jié)果表明菊粉溶液中乙醇含量小于10%時(shí)對(duì)總糖含量的測(cè)定無(wú)影響。丁酸的結(jié)果與乙醇的類似，吸光度(表1)與t檢驗(yàn)(表2)的結(jié)果顯示，菊粉溶液中丁酸含量小于10%時(shí)對(duì)總糖含量的測(cè)定無(wú)影響。

2.7乳酸、1,4-丁二醇對(duì)糖類測(cè)定的影響

由表3可知，含乳酸2%~10%的菊粉溶液與不含乳酸的菊粉對(duì)照樣相比吸光度差異很大，同時(shí)表4的t檢驗(yàn)結(jié)果顯示P值均小于0.01，即含乳酸的菊粉溶液與無(wú)乳酸的對(duì)照樣相比吸光度差異極顯著，結(jié)果表明乳酸對(duì)菊粉溶液總糖含量的影響很大。1,4-丁二醇的結(jié)果與乳酸的類似，吸光度(表3)與t檢驗(yàn)(表4)的結(jié)果顯示，1,4-丁二醇對(duì)菊粉溶液總糖含量的影響很大。為了進(jìn)一步考察乳酸和1,4-丁二醇對(duì)總糖測(cè)定影響的規(guī)律，對(duì)無(wú)菊粉添加的不同濃度的乳酸和1,4-丁二醇溶液經(jīng)過硫酸-蒽酮反應(yīng)對(duì)其吸光度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表5。無(wú)菊粉的乳酸蒽酮反應(yīng)的吸光度結(jié)果顯示(表5)，含乳酸的菊粉溶液的吸光度≈菊粉蒽酮反應(yīng)后的吸光度+乳酸蒽酮反應(yīng)后的吸光度；以含2%的乳酸菊粉溶液為例，無(wú)乳酸的菊粉蒽酮反應(yīng)后的吸光度為0.332(表3)，2%乳酸蒽酮反應(yīng)后的吸光度為0.555(表3)，兩者之和為0.886，而含2%乳酸的菊粉溶液蒽酮反應(yīng)后的吸光度為0.868(表5)。對(duì)含2%、6%、10%乳酸的菊粉溶液蒽酮反應(yīng)后的吸光度和菊粉蒽酮反應(yīng)后的吸光度與乳酸蒽酮反應(yīng)后的吸光度之和的t檢驗(yàn)分析顯示，P值為0.937＞0.05，故兩者無(wú)顯著性差異，所以我們認(rèn)為含乳酸的菊粉溶液蒽酮反應(yīng)后的吸光度=菊粉蒽酮反應(yīng)后的吸光度+乳酸蒽酮反應(yīng)后的吸光度。上述乳酸影響總糖測(cè)定的規(guī)律同樣適用于1,4-丁二醇，以含2%的1,4-丁二醇菊粉溶液為例，無(wú)1,4-丁二醇的菊粉蒽酮反應(yīng)后的吸光度為0.327(表3)，2%1,4-丁二醇蒽酮反應(yīng)后的吸光度為0.018(表3)，兩者之和為0.345，而含2%1,4-丁二醇的菊粉溶液蒽酮反應(yīng)后的吸光度為0.338(表5)。對(duì)含2%、6%、10%1,4-丁二醇的菊粉溶液蒽酮反應(yīng)后的吸光度和菊粉蒽酮反應(yīng)后的吸光度與1,4-丁二醇蒽酮反應(yīng)后的吸光度之和的t檢驗(yàn)分析顯示，P值為0.131＞0.05，故兩者無(wú)顯著性差異。所以我們認(rèn)為含1,4-丁二醇的菊粉溶液蒽酮反應(yīng)后的吸光度=菊粉蒽酮反應(yīng)后的吸光度+1,4-丁二醇蒽酮反應(yīng)后的吸光度。為何乙醇和丁酸對(duì)總糖測(cè)定無(wú)影響，而乳酸和1,4-丁二醇對(duì)總糖測(cè)定的影響非常大呢？推測(cè)應(yīng)該是后兩者在濃硫酸的作用下，可經(jīng)脫水反應(yīng)進(jìn)一步與蒽酮反應(yīng)產(chǎn)生藍(lán)綠色的衍生物而貢獻(xiàn)了部分吸光度。此外，實(shí)驗(yàn)中只是列舉了菊芋代謝產(chǎn)生的幾種典型代謝物對(duì)總糖測(cè)定的影響，菊芋還能發(fā)酵產(chǎn)生2,3-丁二醇[8]、丁二酸[9]、油脂類[10]等一些生物基化學(xué)品，在進(jìn)行總糖測(cè)定時(shí)首先應(yīng)先排除自身的代謝物對(duì)測(cè)定的干擾。

3結(jié)論

采用蒽酮-硫酸法對(duì)總糖進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得最大吸收波長(zhǎng)為620nm。糖-蒽酮的最佳反應(yīng)比例為1:4，最佳反應(yīng)時(shí)間為12min。葡萄糖在0~20μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。結(jié)果表明，建立的總糖測(cè)定方法具有良好的穩(wěn)定性和回收率，適合對(duì)菊芋總糖進(jìn)行監(jiān)測(cè)。此外，乙醇和丁酸(小于10%，v/v)對(duì)總糖的測(cè)定無(wú)影響，但乳酸和1,4-丁二醇(小于10%，v/v)對(duì)總糖測(cè)定結(jié)果影響很大，且規(guī)律為含一定濃度乳酸或1,4-丁二醇的菊粉溶液蒽酮反應(yīng)后的吸光度為菊粉溶液蒽酮反應(yīng)后的吸光度與等濃度乳酸或1,4-丁二醇溶液蒽酮反應(yīng)后的吸光度之和。建立菊芋發(fā)酵過程中總糖的測(cè)定方法對(duì)于監(jiān)控菊芋發(fā)酵過程、測(cè)定代謝速率是必要的，同時(shí)發(fā)酵過程中的主要代謝物可能對(duì)糖類的測(cè)定有一定的影響，所以測(cè)定總糖之前應(yīng)先排除其他物質(zhì)對(duì)于總糖測(cè)定的影響，以保證總糖測(cè)定準(zhǔn)確性。