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本文作者：蘆鑫1,2孫強(qiáng)1,2宋國(guó)輝1,2張麗霞1,2李婧1黃紀(jì)念1,2作者單位：1.河南省農(nóng)科院農(nóng)副產(chǎn)品加工所2.河南省農(nóng)產(chǎn)品生物活性物質(zhì)工程技術(shù)研究中心

花生是世界上廣泛種植的油料作物，2009年全球花生產(chǎn)量為34.40×106t。我國(guó)是花生的生產(chǎn)大國(guó)和消費(fèi)大國(guó)，花生產(chǎn)量居世界第一，年均消費(fèi)花生在12.56×106t[1]。目前，我國(guó)用于制油的花生占花生總消費(fèi)量的一半以上，由此產(chǎn)生大量的花生餅粕。研究發(fā)現(xiàn)花生餅粕中含有多種營(yíng)養(yǎng)成分，其中花生蛋白的含量超過(guò)40%?；ㄉ鞍缀腥梭w所需的8種必需氨基酸，消化性可達(dá)99%，是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、資源豐富的植物蛋白資源[2]。但當(dāng)前我國(guó)花生餅粕主要用于動(dòng)物飼料，資源未得到充分利用，造成資源浪費(fèi)。因此，國(guó)內(nèi)外開(kāi)展從花生粕中提取加工花生蛋白的研究工作，其中將花生蛋白水解制備功能性花生肽是研究的熱點(diǎn)[3-5]。研究表明，以花生蛋白為原料制備的功能性肽具有明確的降血壓(ACE抑制)活性。但目前制備ACE抑制花生肽的工藝以直接加酶水解為主，這種制備方式造成酶活力的浪費(fèi)，增加生產(chǎn)成本，不利于工業(yè)化推廣。由此，本文嘗試采用固定化酶技術(shù)將堿性蛋白酶2709固定后，以ACE抑制率與短肽生成率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用響應(yīng)面技術(shù)優(yōu)化酶解條件，獲得最佳的酶解條件并分析酶解程度與ACE抑制活性之間的關(guān)系，為花生功能性肽的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

低溫花生餅粕：蛋白質(zhì)含量57.60%，水分含量6.53%，油脂含量5.63%，灰分4.90%，河南亮健科技有限公司；堿性蛋白酶2709：酶活225303μ/g，鄭州分子科貿(mào)有限公司；牛血清白蛋白、2,4,6-三硝基苯磺酸(TBNS)、馬尿酰組氨酰亮氨酸(Hippuryl-His-Leu，HHL)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、鄰苯二甲醛(o-Phthaldialdehyde，OPA)、考馬斯G250：美國(guó)Sigma公司；殼聚糖、磷酸二氫鈉、戊二醛、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉等：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

ZDDN-Ⅱ全自動(dòng)凱氏定氮儀：浙江托普儀器有限公司；CaryEclipse熒光光度計(jì)：美國(guó)瓦里安公司；DGX-9243型鼓風(fēng)干燥箱：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LyovacGT1冷凍真空干燥機(jī)：德國(guó)SRK公司；DL-5-B離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；TGL-16A離心機(jī)：金壇市億通電子有限公司；XS205電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；ΜV-2802型紫外可見(jiàn)光光度計(jì)：上海尤尼柯儀器有限公司；XW-80A漩渦混合器：上海青浦滬西儀器廠；DF-101S集熱兼磁力加熱攪拌器：金壇市醫(yī)療儀器廠；ZW-A微量振蕩器：常州博遠(yuǎn)實(shí)驗(yàn)分析儀器廠等。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1花生蛋白的制備

取一定質(zhì)量的低溫花生餅粕，按照料液比1:10(w/v)加入pH為10.0的氫氧化鈉溶液，25℃下恒溫?cái)嚢?h，隨后4000r/min離心20min，回收上清液并測(cè)定上清液的體積。將殘?jiān)匦碌谷霟校尤肱c上清液相同體積的pH10.0的氫氧化鈉溶液，采用相同的攪拌和離心條件，合并1次和2次離心的上清液，采用0.5mol/L的HCl調(diào)節(jié)上清液到pH4.40，4℃靜置6h，4000r/min離心20min，水洗沉淀，冷凍干燥。

1.3.2堿性蛋白酶2709的殼聚糖固定

取一定量的殼聚糖，按料液比1:40(w/v)加入1%的醋酸溶液，室溫?cái)嚢柚敝镣耆芙?。用注射器逐滴將殼聚糖溶液加入?倍體積含有NaOH和乙酸乙酯混合溶液中(NaOH濃度為3%，乙酸乙酯濃度為1.25%)，室溫靜置3h，抽濾，蒸餾水沖洗3次。將殼聚糖微球加入到1.5%戊二醛溶液中，室溫?cái)嚢?h，更換戊二醛溶液后，重新加入1.5%戊二醛溶液，4℃靜置過(guò)夜，抽濾，用蒸餾水和丙酮交替多次洗滌。將活化的殼聚糖微球加入到1%堿性蛋白酶溶液，室溫?cái)嚢?2h，隨后抽濾除去游離蛋白酶，4℃冰箱保存，其酶活力回收率為57.12%。

1.3.3固定化酶制備ACE抑制花生肽

將花生蛋白配成5%花生蛋白溶液后，在90℃加熱10min。取100mL熱處理后的花生蛋白溶液加入一定量的固定化堿性蛋白酶2709，在設(shè)定溫度下，恒溫?cái)嚢枞舾蓵r(shí)間后，取上清液測(cè)定短肽生成率、水解度和ACE抑制率，抽濾回收殼聚糖微球，酶解液4℃儲(chǔ)存。結(jié)合前期研究，發(fā)現(xiàn)加酶量、酶解溫度、酶解pH、酶解時(shí)間為影響酶解效果的關(guān)鍵因素。對(duì)以上因素的低、中、高水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼，隨后采用SAS9.1.3軟件按Box-Behnken方法安排實(shí)驗(yàn)條件，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4測(cè)定方法

1.4.1蛋白水解度測(cè)定

取0.25mL上清液加入到試管中，隨后加入2mL，濃度0.1%(v/v)TNBS和2mL0.2mol/LpH8.20磷酸緩沖液，置于水浴鍋中50℃水浴振蕩60min，水浴過(guò)程中，采用鋁箔覆蓋遮光。隨后用4mL0.1mol/L的鹽酸進(jìn)行終止反應(yīng)，室溫靜置30min，以L-亮氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用340nm測(cè)定吸光度[6]。蛋白水解度計(jì)算公式如下：水解度(%)=h/htot×100(1)式中：h為水解物中1g被裂解肽鍵量，mmol/g；htot為1g原料蛋白質(zhì)總肽鍵量，mmol/g；花生蛋白的htot為7.49mmol/g[7]。

1.4.2短肽得率測(cè)定

參照趙世光等人的方法，并稍作修改[8]。取2.5mL酶解液，加入等體積10%(w/v)的三氯乙酸，混勻，4℃靜置30min，采用10000r/min離心20min。取離心后上清液和酶解液適當(dāng)稀釋，采用考馬斯亮藍(lán)G-250測(cè)定肽類質(zhì)量和蛋白總質(zhì)量，測(cè)定波長(zhǎng)為595nm，以牛血清白蛋白做為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。肽鏈得率(%)=(肽鏈質(zhì)量/上清液中蛋白總質(zhì)量)×100

1.4.3ACE抑制活性測(cè)定

將酶解液適當(dāng)稀釋，使用96孔酶標(biāo)板作為反應(yīng)容器。將20μL樣液(無(wú)抑制的反應(yīng)液中以蒸餾水代替)與40μL底物溶液(底物是4.66mmol/LHHL的氯化鈉磷酸緩沖液)混合，然后加入40μL酶活濃度為12.5mU/mLACE酶液(對(duì)照液中以蒸餾水代替)，在微孔板混合器上混勻后置于37℃恒溫箱中反應(yīng)1h，然后加入1.2mol/LNaOH溶液150μL終止酶反應(yīng)。接著在反應(yīng)液中加入2%OPA甲醇溶液40μL，混合均勻，室溫下靜置20min后加入6mol/L的HCl溶液40μL終止衍生反應(yīng)。將上述溶液稀釋50倍后，測(cè)定熒光吸收強(qiáng)度，測(cè)定的激發(fā)波長(zhǎng)340nm；發(fā)射波長(zhǎng)為455nm；狹縫寬度為5nm。樣液的ACE抑制活性的計(jì)算公式如下：ACE抑制率(%)=[1-(a-c)÷(b-d)]×100(2)式中：a為抑制劑與ACE都存在時(shí)的熒光吸收強(qiáng)度；b為抑制劑不存在而ACE存在時(shí)的熒光吸收強(qiáng)度；c為抑制劑存在而ACE不存在時(shí)的熒光吸收強(qiáng)度；d為抑制劑與ACE都不存在時(shí)的熒光吸收強(qiáng)度。ACE抑制率越大，表明該樣品的ACE抑制活性越強(qiáng)。

1.4.4其他測(cè)定方法

低溫花生餅粕成分測(cè)定方法如下：蛋白測(cè)定采用凱氏定氮法GB5009.5—2010，N為5.46；灰分測(cè)定采用550℃灰化法GB/T5505—2008；水分測(cè)定采用105℃恒重法GB5512—1985；粗脂肪測(cè)定采用索氏抽提法GB/T14772—2008。蛋白酶酶活標(biāo)定采用Folin法SB/T10317—1999，其酶活測(cè)定pH為10。

1.5數(shù)據(jù)處理

無(wú)特殊說(shuō)明，實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次。采用SAS9.1.3和MicrosoftofficeExecl2007分析和處理數(shù)據(jù)。本文中，p<0.01為高度顯著，p<0.05為顯著。

2討論與分析

2.1酶解條件對(duì)短肽生成率的影響

采用SAS分析短肽生成率(見(jiàn)表2)發(fā)現(xiàn)，整個(gè)模型高度顯著(p=0.0001)，這表明響應(yīng)面模型真實(shí)反映客觀事實(shí)；失擬項(xiàng)不顯著(p=0.0538)，這說(shuō)明沒(méi)有遺漏重要的影響因子，選取的酶解因素全面；R2=98.90，調(diào)整R2=97.62%，這說(shuō)明響應(yīng)面模型和實(shí)際結(jié)果擬合程度好。分析影響因素發(fā)現(xiàn)，加酶量和酶解時(shí)間是高度顯著因素(p<0.01)，酶解pH是顯著因素(p=0.0171)，酶解溫度是非顯著因素(p=0.7779)。酶解溫度是非顯著因素的原因可能是固定化酶增強(qiáng)了堿性蛋白酶的耐熱穩(wěn)定性。獲得的擬合曲線如下(實(shí)際值)：（略）。由于酶解溫度是非顯著影響因素，下面只分析加酶量、酶解pH和酶解時(shí)間對(duì)短肽生成率的影響。由圖1(a)可知，當(dāng)酶解溫度為45℃，酶解pH為10時(shí)，固定酶解時(shí)間為120min考察加酶量對(duì)短肽生成率的作用可以發(fā)現(xiàn)，加酶量從1200增加到1600μ/g蛋白時(shí)，可以顯著提高短肽生成率，但繼續(xù)增加加酶量到2000μ/g蛋白時(shí)，短肽生成率增加緩慢。這是由于增加加酶量增加酶分子與底物之間碰撞機(jī)率，從而加速酶水解的反應(yīng)速率，單位時(shí)間內(nèi)提高短肽生成率。但在反應(yīng)體系內(nèi)，底物的酶作用位點(diǎn)有限，底物充分水解后，反應(yīng)達(dá)到平衡，繼續(xù)加入蛋白酶不能提高短肽生成率。當(dāng)固定加酶量為1600μ/g蛋白時(shí)，酶解時(shí)間從60min延長(zhǎng)120min，短肽生成率迅速上升，當(dāng)酶解時(shí)間從120min延長(zhǎng)到180min時(shí)，短肽生成率增加緩慢。這是因?yàn)槊阜磻?yīng)剛開(kāi)始時(shí)，體系中有豐富的底物可以被酶水解，此時(shí)增加反應(yīng)時(shí)間，短肽生成率增加，但隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系內(nèi)反應(yīng)底物與生成物達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間也不能有效提高短肽生成率。由圖1(b)可知，當(dāng)酶解溫度為45℃，酶解時(shí)間為120min時(shí)，固定加酶量為1600μ/g蛋白時(shí)，當(dāng)酶解pH從9增加到10時(shí)，短肽生成率上升，繼續(xù)增加pH到11，短肽生成率有所下降。盡管固定化酶在一定程度上提高酶對(duì)溫度、pH的耐受性，但從結(jié)果來(lái)看，體系pH依然會(huì)影響固定化的堿性蛋白酶在反應(yīng)體系中的構(gòu)象，從而帶來(lái)酶催化活性差異，從而對(duì)短肽生成率產(chǎn)生影響。

2.2酶解條件對(duì)蛋白水解度的影響

蛋白水解度是衡量蛋白水解程度的重要指標(biāo)。響應(yīng)面分析發(fā)現(xiàn)，模型高度顯著(p=0.0001)，失擬項(xiàng)不顯著(p=0.0515)，R2=0.9831，調(diào)整R2為0.9635，因此該模型真實(shí)反映水解度變化情況，可以進(jìn)行影響因素方差分析。分析影響因素發(fā)現(xiàn)，加酶量和酶解時(shí)間都是高度顯著影響因素(p=0.0001)，而酶解溫度和酶解pH是非顯著影響因素(p=0.3880和0.2218)。獲得的回歸方程如下(實(shí)際值)：（略）。由圖2(a)所示，當(dāng)酶解溫度為45℃，酶解pH為10，固定加酶量分析酶解時(shí)間的影響，酶解時(shí)間從60min增加到120min，蛋白的水解度迅速增加，當(dāng)酶解時(shí)間從120min延長(zhǎng)到180min，蛋白水解度增加放緩。由于每種蛋白酶都有其特定酶水解位點(diǎn)，因此酶解反應(yīng)是有限水解，反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，其水解度逐漸趨于穩(wěn)定，這也是酶解時(shí)間從120min延長(zhǎng)到180min時(shí)，蛋白水解度變化不明顯的原因。當(dāng)固定酶解時(shí)間分析加酶量影響時(shí)，增加加酶量有利于蛋白水解，因此獲得酶解產(chǎn)物的水解度較高，但當(dāng)加酶量繼續(xù)增加，酶解反應(yīng)速度加快，水解產(chǎn)物快速生成并在體系中濃度達(dá)到穩(wěn)定，因此水解度變化不明顯。

2.3酶解條件對(duì)ACE抑制活性的影響

研究表明：酶解法制備ACE抑制肽受多種因素的影響，如蛋白酶種類、蛋白底物種類、酶解條件、酶解程度等[9-10]。分析表2中的ACE抑制率結(jié)果發(fā)現(xiàn)：模型高度顯著(p=0.0001)，失擬項(xiàng)不顯著(p=0.0522)，R2=93.34%和調(diào)整R2=85.57%，因此模型真實(shí)客觀的反映酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性。方差分析發(fā)現(xiàn)：加酶量和酶解時(shí)間是高度顯著影響因素(p=0.0001)，而酶解溫度和酶解pH是非顯著影響因素(p=0.7055和0.7488)，獲得的回歸方程如下(實(shí)際值)：（略）。加酶量和酶解時(shí)間對(duì)ACE抑制率的影響見(jiàn)圖2(b)。由圖2(b)可知，當(dāng)酶解溫度為45℃，酶解pH為10，固定加酶量分析酶解時(shí)間的影響發(fā)現(xiàn)，延長(zhǎng)酶解時(shí)間有利于酶解液ACE抑制活性的提高，但超過(guò)140min后，ACE抑制活性有所下降。具有ACE抑制活性的多肽是蛋白酶解產(chǎn)物的一部分，延長(zhǎng)酶解時(shí)間會(huì)使這部分多肽被降解，逐漸喪失ACE抑制活性，從而降低ACE抑制率。固定酶解時(shí)間分析加酶量影響發(fā)現(xiàn)，適量增加加酶量有利于ACE抑制肽的生成，過(guò)量的加酶量反而會(huì)使ACE抑制肽水解，導(dǎo)致ACE抑制率下降。

2.4短肽生成率、水解度和ACE抑制率的關(guān)系

工業(yè)化制備ACE抑制肽需要兼顧2個(gè)指標(biāo)：短肽生成率和ACE抑制率。由于蛋白酶解反應(yīng)復(fù)雜，會(huì)產(chǎn)生多種性質(zhì)不同的多肽產(chǎn)物。因此，需要通過(guò)水解度來(lái)衡量酶解產(chǎn)物組成和控制酶解反應(yīng)程度。在現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)條件下，酶解條件中加酶量和酶解時(shí)間對(duì)短肽生成率、水解度和ACE抑制率具有高度顯著影響，因此以加酶量和酶解時(shí)間作為自變量，短肽生成率、水解度和ACE抑制率作為應(yīng)變量作圖，考察它們?cè)诿附鈼l件改變后，它們之間的相互關(guān)系。由圖4(a)可知，隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，蛋白水解度和短肽生成率上升，且二者具有高度的正相關(guān)性，即低的水解度往往對(duì)應(yīng)著較低的短肽生成率，當(dāng)水解度大于18%時(shí)，短肽生成率在80%以上。由圖4(b)可知，伴隨著水解度的增加，酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性迅速增加，但從水解度和ACE抑制率曲線變化趨勢(shì)可知，過(guò)高的水解度并不對(duì)應(yīng)高的ACE抑制活性。這是可能是多肽的過(guò)分水解后，喪失了ACE抑制結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致ACE抑制活性下降。由圖4(c)可知，適當(dāng)增加加酶量和酶解時(shí)間會(huì)提高短肽生成率和ACE抑制率，但過(guò)度延長(zhǎng)水解過(guò)程和增加加酶量，短肽產(chǎn)率增加有限而ACE抑制率下降。短肽生成率最大值對(duì)應(yīng)的酶解條件和ACE抑制率最大值的酶解條件不重合。通過(guò)SAS計(jì)算，獲得最大短肽生成率的酶解條件為：加酶量取1765.98μ/g蛋白，酶解時(shí)間為181.61min，酶解pH為10.07，酶解溫度為45.08℃，此時(shí)對(duì)應(yīng)的短肽生成率為84.95%±0.60%。獲得最大ACE抑制率的酶解條件為：加酶量為1766.73μ/g蛋白，酶解時(shí)間為142.26min，酶解pH為9.97，酶解溫度為45.25℃，此時(shí)對(duì)應(yīng)的短肽生成率為84.00%±2.87%。為了獲得高的ACE抑制活性和短肽產(chǎn)率，最佳的酶解條件確定為：加酶量1767μ/g蛋白，酶解時(shí)間143min，酶解pH為10.00，酶解溫度取45℃，獲得的短肽生成率和ACE抑制率為82.67%和83.48%。

3結(jié)論

采用殼聚糖固定堿性蛋白酶2709水解花生蛋白制備ACE抑制肽發(fā)現(xiàn)：加酶量酶解時(shí)間是影響短肽生成率、ACE抑制率和水解度的高度顯著因素。最佳的酶解工藝是：加酶量1767μ/g蛋白，酶解時(shí)間143min，酶解pH為10.00，酶解溫度取45℃，獲得的短肽生成率和ACE抑制率為82.67%和83.48%。分析短肽生成率、蛋白水解度和ACE抑制率的相互關(guān)系發(fā)現(xiàn)：適當(dāng)增加水解度可以提高酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性，但過(guò)度水解會(huì)導(dǎo)致ACE抑制率下降。