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【摘要】目的探討胡椒醇提液外用對兔耳輕度凍傷的治療效果。方法用－15℃左右低溫液復制兔耳輕度凍傷模型，凍傷后48h開始在兔凍耳涂抹胡椒70%乙醇提取液治療，2d后測定血清中SOD活性、MDA和TNF-α含量，4d后評價凍耳外觀正常與否及變形程度，制作凍耳組織病理切片，顯微鏡下觀察凍耳組織病理變化，同時測定血清與凍耳組織中SOD活性、MDA和TNF-α含量。結果用胡椒70%乙醇提取液治療2d后血清中SOD活性顯著增加，MDA量顯著降低，TNF-α量無明顯變化。治療4d后血清中SOD活性、MDA和TNF-α含量均無明顯差異，但凍耳組織中SOD活性與TNF-α水平顯著提高，MDA量顯著降低。另外凍耳外觀評價與組織病理檢查顯示凍耳組織壞死范圍減少，修復速度明顯提高。結論胡椒70%乙醇提取液局部外用對輕度凍傷有治療作用。

【關鍵詞】胡椒；凍傷；治療作用

胡椒是傳統(tǒng)中藥，為胡椒科植物胡椒PipernigrumL.的干燥近成熟或成熟果實。民間有用胡椒粉煮水或泡酒擦洗患處治療凍瘡的用法，并且療效確切。筆者所在研究組欲對胡椒抗凍瘡作用進行動物實驗驗證，通過查閱中外文獻數(shù)據(jù)庫（包括中國CNKI和VIP科技論文全文數(shù)據(jù)庫，美國Gale、Pubmed和HighWirePress數(shù)據(jù)庫），未能檢索到動物凍瘡實驗模型的報道。研究組曾根據(jù)凍瘡病因病機試制動物凍瘡模型，但均未成功。臨床上認為Ⅰ，Ⅱ度（輕度）凍傷和凍瘡的臨床表現(xiàn)及治療基本一致，因此在沒有凍瘡動物模型可用的情況下，藥物對輕度凍傷的療效仍可作為對凍瘡治療作用的參考，有積極意義。

兔耳凍傷后由于局部細胞發(fā)生變性或壞死，兔耳形態(tài)和組織結構會有所改變，變性的細胞如及時恢復供血供氧，清除損傷因子，能轉(zhuǎn)為正常，反之，如持續(xù)缺血缺氧，則損傷可進一步加重，直至壞死。壞死表皮可由周圍正常表皮再生修復，真皮壞死則只能通過肉芽組織填補修復，修復后兔耳形態(tài)和組織結構不能恢復正常；另外，因凍傷后機體氧化抗氧化系統(tǒng)平衡被打破，丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）這對反映組織氧化損傷程度與抗氧化能力的生化指標會發(fā)生相應變化；近年來腫瘤壞死因子α（TNF-α）在創(chuàng)傷和創(chuàng)傷修復中的作用越來越受人們關注。現(xiàn)已證實，在創(chuàng)傷修復早期TNF-α能誘導白細胞脫顆粒，增強其吞噬能力，加速肉芽組織及肉芽組織內(nèi)新生血管形成［1～3］。在修復中、后期高濃度TNFα能抑制成纖維細胞膠原蛋白基因的轉(zhuǎn)錄,同時可以引起膠原酶基因轉(zhuǎn)錄的顯著增加,因而TNFα在組織的重塑中具有重要意義，可減少瘢痕組織形成，提高修復質(zhì)量［4，5］。也就是說，在創(chuàng)傷修復早期適當濃度的TNFα能加速創(chuàng)面修復，中、后期高濃度TNFα能提高修復質(zhì)量［6］。該文通過觀察凍傷兔耳治療后外觀形態(tài)與組織病理改變情況，測定血清和凍耳組織中MDA、SOD、TNF-α含量綜合評價胡椒局部外用對兔耳輕度凍傷的治療作用，進而研究胡椒抗凍瘡的效果。

1儀器與材料

1.1儀器

2010型酶標儀（奧地利AnthosLabtecInstruments公司）；756MC紫外可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）。

1.2試藥

取白胡椒（購自東駿大藥房），用70%乙醇冷浸3次（48，24，24h），合并浸提液，靜置分層，過濾，濾液用70%乙醇配制為高、中兩種濃度供試液，每毫升分別相當于生藥3.30，1.65g；MDA和SOD試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為：20071228，20071227）；TNFα試劑盒（美國AdlitteramDiagnosticLaboratories公司，批號：RT110371）。

1.3動物

日本大耳白兔40只，體質(zhì)量2.0～3.0kg，雌雄兼用，由昆明醫(yī)學院實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（滇）2005-0008。

2方法

2.1凍傷模型復制與給藥

［7］取家兔分為4組，即正常、溶劑和高、中濃度胡椒供試液組，每組10只，于實驗室正常單籠飼養(yǎng)6d后將右耳耳尖至耳根7cm范圍剪毛，隔日將右耳剪毛區(qū)域浸入（-15±1）℃冷凍液（6份碎冰+1份氯化鈉）中，正常組除外。待兔耳變白變硬后再凍30s，取出，空氣中停留20s后以35℃溫水復溫20s，取出兔耳，擦干水分，凍傷模型復制完畢。凍傷后48h開始在凍傷兔耳剪毛區(qū)域分別涂藥，1ml/次，3次/d，涂藥4d后，治療結束。

2.2凍耳治療后外觀評價

凍耳皺縮變形的范圍大小反映了組織細胞壞死和瘢痕修復的范圍大小，是藥物對凍傷所致組織細胞變性的保護和促恢復作用的直接體現(xiàn)。此處將凍耳治療后外觀評價由好到差分為4級：正常（凍耳治療后顏色、外觀、觸感和厚度與正常兔耳完全一樣）、輕度變形(凍耳耳尖至耳根方向2cm區(qū)域內(nèi)皺縮變形)、中度變形(耳尖至耳根方向4cm區(qū)域內(nèi)皺縮變形)、重度變形(耳尖至耳根方向皺縮變形范圍超過4cm)。

2.3凍耳病理檢查

治療4d后，家兔左耳耳緣靜脈空氣栓塞致死，立即沿浸凍線剪下凍耳浸凍部分，由耳尖垂直于浸凍線方向?qū)龆霾糠旨舫蓪ΨQ的兩半，一半以4%甲醛溶液固定（另一半留做SOD、MDA和TNF-α測定），分別在耳尖向耳根方向1，2，3cm處取材，常規(guī)石蠟包埋，HE染色，以正常兔耳為對照，顯微鏡下觀察凍耳組織病理變化。

2.4SOD、MDA和TNFα測定

［8］涂藥2d后，左耳中央動脈取血約4ml。涂藥4d后心臟取血約4ml，取“2.3”項下病理檢查剪下的另一半凍耳，剪取耳尖部，置事先盛有預冷生理鹽水的小燒杯中，涮洗幾下，取出，濾紙吸干水分，稱1g耳尖部組織，用10ml預冷pH7.4的0.01mol/L的PBS制備組織勻漿。血液與組織勻漿4℃分別以4000r/min和2000r/min離心10min，取血清和耳組織勻漿上清，按試劑盒中操作方法測定SOD總活力、MDA與TNF-α含量。

2.5統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)均用SPSS13.0統(tǒng)計，其中凍耳治療后外觀評價用秩和檢驗Mann-WhitneyU法，SOD、MDA和TNFα測定結果用方差分析LSD法。

3結果

3.1凍耳外觀變化

復溫后兔耳開始發(fā)紅發(fā)熱，隨后變紫、腫脹、下垂。腫脹逐漸加劇，12h后部分兔耳出現(xiàn)漿液性水泡，泡液無色或淡黃色，隨后水泡增大或新水泡形成。24h后腫脹程度不再增加，水泡不再增大或無新水泡形成。48h后部分兔耳凍區(qū)有黃色液體滲出。治療后凍耳腫脹逐漸消退，治療結束（治療4d）后各組凍耳均已不見明顯腫脹。高、中濃度胡椒供試液組治療結束后分別有4只和2只家兔凍耳外觀同正常兔耳（凍耳表皮光滑平整，未見壞死，凍耳顏色、觸感、彈性和厚度均與未凍傷的左耳完全一樣），其它家兔凍耳均有不同程度的皺縮變形和硬化、表面凹凸不平、表皮壞死，個別家兔凍耳表面有硬痂產(chǎn)生。高濃度胡椒供試液組治療結束后凍耳外觀評價明顯好于溶劑組（P<0.01）。結果見表1。表1胡椒對輕度凍傷兔耳形態(tài)改變的影響（略）

3.2凍耳治療后病理變化

治療后高、中濃度胡椒供試液組兔凍耳表皮均修復完整，真皮水腫及炎癥均明顯消退，部分兔凍耳真皮已無水腫和炎癥表現(xiàn)（高濃度5只，低濃度3只），近半數(shù)兔凍耳毛囊和皮脂腺數(shù)量正常（高濃度6只，中濃度4只），未見毛囊和皮脂腺壞死，凍耳總體恢復程度和速度明顯好于溶劑組，見圖1。

3.3SOD測定結果

治療2d后，高、中濃度胡椒供試液組血清中SOD活力均顯著高于溶劑組（P<0.01）。治療4d后各組血清中SOD活力已無明顯差異，但凍耳組織中SOD活力有明顯不同，高、中濃度胡椒供試液組顯著高于溶劑組（高濃度P<0.01，中濃度P<0.05）。結果見表2。表2胡椒對兔耳輕度凍傷后血清及凍耳組織中SOD活力的影響（略）

3.4MDA測定結果

治療2d后，高、中濃度胡椒供試液組血清中MDA量顯著低于溶劑組（P<0.01）。治療4d后各組血清中MDA量均一定程度下降，與正常組相比已無明顯差異，但此時凍耳組織中MDA量有差異，高、中濃度胡椒供試液組顯著低于溶劑組（高濃度P<0.01，中濃度P<0.05）。結果見表3。表3胡椒對兔耳輕度凍傷后血清及凍耳組織中MDA含量的影響（略）

3.5TNF-α測定結果

治療2d和4d后，高、中濃度胡椒供試液組血清中TNF-α量與溶劑組相比均無明顯差異，但治療4d后凍耳組織中TNF-α量顯著高于溶劑組（P<0.01）。結果見表4。表4胡椒對兔耳輕度凍傷后血清及凍耳組織中TNF-α含量的影響（略）

4討論

兔耳凍傷后形態(tài)改變的范圍實際上反映了凍耳存活的組織細胞面積和存活量。所以，治療結束后，通過兔凍耳外觀正常與否及形態(tài)異常范圍可評價藥物抗凍傷的療效，藥物如能減少耳凍傷后細胞壞死的數(shù)量和范圍，則凍耳形態(tài)改變區(qū)域就小。此次研究結果顯示，高濃度胡椒供試液能顯著降低兔耳輕度凍傷后形態(tài)改變程度（P<0.01）,并且治療結束后4/10凍耳形態(tài)與正常兔耳完全一致。

凍傷4d（治療2d）后兔血循環(huán)中SOD活力還明顯低于正常，相應的脂質(zhì)過氧化物MDA含量明顯高于正常，但胡椒供試液能顯著增強血液中SOD活力，減少MDA的產(chǎn)生。凍傷6d（治療4d）后血循環(huán)中SOD活力和MDA水平基本恢復正常，但凍耳組織中SOD活力明顯低于正常，另外MDA量也明顯高于正常，更有意義的是胡椒供試液能顯著增加凍耳組織中SOD活力并降低MDA水平。由此說明，兔耳局部輕度（主要是Ⅱ度）凍傷后不僅能打破受凍局部組織氧化抗氧化系統(tǒng)的平衡，并且因此可使全身血循環(huán)中氧化抗氧化系統(tǒng)受累，最終導致失衡。氧化抗氧化系統(tǒng)失衡的順序為局部凍傷組織到全身血循環(huán)，而恢復的順序則正好相反。另外實驗結果也說明，凍傷局部應用胡椒70%乙醇提取液能有效增加機體抗氧化能力，抑制受凍組織氧化損傷。

兔凍耳局部胡椒供試液治療2d和4d后血液中TNF-α水平與溶劑組相比均無明顯差別，值得關注的是，治療4d（凍傷6d）后凍耳組織中TNF-α含量顯著高于溶劑組。前面已經(jīng)述及在修復中、后期高濃度的TNF-α能促進組織重塑，提高修復質(zhì)量，這與凍耳治療后外觀評價、組織病理及MDA與SOD活力測定結果相吻合。

兔足輕、重度凍傷后72h內(nèi)SOD活性和MDA量的變化［9］、大鼠重度凍傷后72h內(nèi)SOD活性、MDA和TNF-α含量的變化［10］國內(nèi)已見報道，但凍傷后更長時間的上述指標的定量及變化還沒有文獻，加之凍傷后生化指標變化的研究報道數(shù)量很有限，所以藥物抗凍傷的藥效研究都未就凍傷后這些指標的變化進行測定。此次胡椒對兔耳輕度凍傷的作用研究中SOD活性、MDA和TNF-α含量變化測定結果對藥物抗輕度凍傷和凍瘡藥效評價有一定參考價值。超級秘書網(wǎng)：

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