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【摘要】目的檢測新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemicencephalopathy,HIE)患兒紅細(xì)胞內(nèi)外鈣濃度及紅細(xì)胞膜上Ca2+-Mg2+-ATPase活性,研究所檢測指標(biāo)與腦損傷程度之間的關(guān)系,并探討出現(xiàn)低鈣血癥時(shí)能否鈣劑治療,從而最大限度地提高HIE的療效,減少死亡和傷殘。方法采用流式細(xì)胞儀測定86例不同程度新生兒缺氧缺血性腦病患者紅細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度,以I-STAT1-Analyzer測定血漿游離鈣,以化學(xué)比色法測定紅細(xì)胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase活性;以30例足月新生兒作為對照組,均為羊水吸入和咽下綜合征患者。將HIE組中部分患兒再分為補(bǔ)充鈣劑組與未補(bǔ)充鈣劑組,當(dāng)補(bǔ)充鈣劑療程結(jié)束后再次檢測各組相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果HIE急性期血漿游離鈣濃度水平均明顯低于對照組,(P<0.05),紅細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度水平均明顯高于對照組(P<0.05),紅細(xì)胞膜上Ca2+-Mg2+-ATPase活性明顯低于對照組(P<0.05);這些指標(biāo)的變化與腦損傷的嚴(yán)重程度相關(guān);在補(bǔ)充鈣劑后紅細(xì)胞膜上Ca2+-Mg2+-ATPase活性及紅細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度均與未補(bǔ)充鈣劑組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而血漿游離鈣濃度較未補(bǔ)鈣組顯著升高(P<0.05)。結(jié)論HIE時(shí)紅細(xì)胞內(nèi)鈣超載,血漿游離鈣降低,且紅細(xì)胞膜上Ca2+-Mg2+-ATPase活性降低;補(bǔ)充鈣劑后紅細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度并未明顯上升,故而HIE時(shí)對有低鈣血癥臨床表現(xiàn)的患兒補(bǔ)充鈣劑是可行的,但本研究并未解決補(bǔ)充鈣劑后是否會(huì)延長細(xì)胞內(nèi)鈣超載的持續(xù)時(shí)間,因此提出以短期應(yīng)用為妥,一旦臨床表現(xiàn)緩解即可停止補(bǔ)充,血漿游離鈣僅做為參考。

【關(guān)鍵詞】新生兒;缺氧缺血性腦病;紅細(xì)胞內(nèi)外鈣濃度;紅細(xì)胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase活性

【Abstract】ObjectiveToresearchtherelationshipbetweensomedetectiveindicatorsandtheneonatalhypoxic-ischemicencephalopathy(HIE)braininjury,bydetectingtheCa2+concentrationsinsideandoutsideoferythrocytesaswellasCa2+-Mg2+-ATPaseactivityonerythrocytemembranesinchildrenwithHIE.Meanwhile,todiscusswhetherthecalciumtreatmentcouldbeusedinthesituationofhypocalcemiaforthepurposeofimprovingtheeffectofHIEmaximatilyanddecreasingmortalityanddisability.MethodsTheclinicalof86caseswithHIEneonatuswerestudited.86casesofHIEneonatus,wedetectederythrocyteintracellularCa2+concentrationbyflowcytometry,plasmafreecalciumbyI-STAT1-AnalyzeranderythrocytemembranesCa2+-Mg2+-ATPaseactivitybychemicalassay.Asthecontrolgroup,30casesoffullterminfantsweretakenwhowereallinhaledandingestedamnioticfluid.TheHIEgroupwassubdividedintogroupswithandwithoutcalciumsupplement.Theaboveindicatorsweredetectedagainingroupsattheendofcalciumtreatment.

ResultsInHIEacutephase,plasmafreeCa2+concentrationsweresignificantlylowerthanthecontrolgroup(P<0.05),erythrocyteintracellularfreeCa2+concentrationweresignificantlyhigherthanthecontrolgroup(P<0.05),erythrocytemembraneCa2+-Mg2+-ATPaseactivitywassignificantlylowerthanthecontrolgroup(P<0.05).Thesechangesarerelevantwiththeseverityofbraininjury.Aftercalciumsupplement,erythrocytemembraneCa2+-Mg2+-ATPaseactivityanderythrocyteintracellularfreeCa2+concentrationswerenosignificantdifferenceswiththatwithoutaddedcalciumgroup(P>0.05),whiletheplasmaconcentrationoffreecalciumwassignificantlyhigher(P<0.05).

ConclusionErythrocyteintracellularcalciumionisoverloaded,plasmafreeCa2+concentrationanderythrocytemembraneCa2+-Mg2+-ATPaseactivityaredecreasedinHIE.Aftercalciumsupplement,erythrocyteintracellularfreeCa2+concentrationdidnotsignificantlyincrease.calciumsupplementisfeasibleinHIEchildrenwithhypocalcemia.Butthisstudydidnotaddresswhethertheadditionalcalciumwouldextendintracellularcalciumoverloadduration.Therefore,short-termapplicationshouldbeusedaslongastheremissionofclinicalmanifestations.Andplasmafreecalciumisareferenceonly.

【Keywords】

Newborn;Hypoxic-ischemicencephalopathy;Ca2+concentrationinsideandoutsideoferythrocytes;ErythrocytemembraneCa2+-Mg2+-ATPaseactivity

鈣與新生兒缺氧缺血性腦病的關(guān)系已得到公認(rèn),1977年Nicholson第一次提出鈣介導(dǎo)缺氧缺血后神經(jīng)元死亡的學(xué)說[1],1992年Schurr等在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Ca2+超載假說最能說明缺氧缺血性腦損傷后神經(jīng)元死亡的機(jī)制,其后研究已證實(shí)缺氧缺血常引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載,諸多實(shí)驗(yàn)都證實(shí)在缺氧造成的神經(jīng)元損傷時(shí),有細(xì)胞內(nèi)的鈣異常蓄積,這種變化比神經(jīng)細(xì)胞壞死出現(xiàn)得早,鈣濃度增高的程度也與神經(jīng)細(xì)胞壞死的數(shù)量成正比[2],細(xì)胞內(nèi)過度升高的鈣離子可觸發(fā)一系列有害的酶反應(yīng)過程,最終導(dǎo)致不可逆的細(xì)胞損害被認(rèn)為是與其細(xì)胞受損的中心環(huán)節(jié),是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或死亡的“最后共同途徑”。但在細(xì)胞內(nèi)鈣超載的同時(shí)常伴有血漿游離鈣的降低,而是否應(yīng)該予以補(bǔ)充鈣劑以及如何補(bǔ)充鈣劑一直存在爭議,一般認(rèn)為HIE患兒的總鈣并不低而只是鈣分布異常,并非真正缺乏,補(bǔ)充鈣劑后細(xì)胞外液Ca2+增加有可能造成鈣再次大量內(nèi)流進(jìn)而造成細(xì)胞損傷,因而建議使用鈣通道阻滯劑協(xié)助治療,但目前還沒有證明對HIE安全而有效的鈣通道阻滯劑;亦有研究認(rèn)為出現(xiàn)驚厥、呼吸障礙等低鈣血癥的癥狀后如不及時(shí)予以緩解會(huì)進(jìn)一步加重腦損傷,故建議補(bǔ)充鈣劑。

本文主要研究HIE患兒紅細(xì)胞內(nèi)外鈣濃度及紅細(xì)胞膜上Ca2+-Mg2+-ATPase活性及其這些指標(biāo)與腦損傷的相關(guān)性,并且進(jìn)一步研究補(bǔ)充鈣劑后各相關(guān)指標(biāo)變化,從而為HIE出現(xiàn)低鈣血癥時(shí)是否能夠補(bǔ)鈣以及如何補(bǔ)鈣尋找依據(jù),以利于最大限度地提高HIE的療效,減少死亡和傷殘。

1對象和方法

1.1研究對象

1.1.1HIE組根據(jù)2004年中華醫(yī)學(xué)會(huì)新生兒學(xué)組在長沙最新制定的診斷和分度標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷和分組[2],均為2006年7月以后在山西省兒童醫(yī)院新生兒科住院的患兒,共82例,其中,男52例,女30例,平均胎齡(39.28±1.54)周,平均年齡(12.67±7.47)h。有感染性疾病、溶血性疾病、先天性疾病的患兒排除在外。

1.1.2對照組選擇同期在新生兒科住院的30例足月早期新生兒作為對照組,均為羊水吸入和咽下綜合征患者。其中,男18例,女12例,均無圍產(chǎn)期窒息史,無感染性疾病、溶血性疾病和先天性疾病,無宮內(nèi)發(fā)育遲緩,其母孕期健康。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,該組新生兒在胎齡、日齡、出生體重等組成上與HIE組差異無顯著性(P>0.05),見表1。

表1

不同程度HIE組患兒和對照組患兒的一般資料

組別例數(shù)年齡(h)胎齡(W)出生體重(kg)

輕度HIE組3011.85±6.6539.05±1.213.63±0.35

中度HIE組3013.19±8.4039.23±1.513.36±0.49

重度HIE組2212.96±8.5839.56±1.063.23±0.65

對照組3015.92±8.6138.30±1.273.39±0.53

F值0.3261.6012.345

P值>0.05>0.05>0.05

1.1.3補(bǔ)鈣組和非補(bǔ)鈣組

HIE組中30例患兒出現(xiàn)低游離鈣血癥同時(shí)出現(xiàn)相關(guān)臨床表現(xiàn)(驚厥,呼吸障礙),按照家長意愿補(bǔ)鈣者20例,未補(bǔ)鈣者10例,分別列入補(bǔ)鈣組和非補(bǔ)鈣組。

1.2研究方法

1.2.1標(biāo)本采集86例HIE患兒均于入院當(dāng)天(生后0~3d、急性期)、30例非HIE組于生后0~3d均用真空管(EDTA抗凝)常規(guī)取靜脈血2ml,取血待測;均同時(shí)采約120μl動(dòng)脈血測定血漿游離鈣,且在HIE補(bǔ)充鈣劑組于補(bǔ)充鈣劑3d后、HIE非補(bǔ)鈣組常規(guī)治療3d后,再次以相同的方法采血,測定各組相關(guān)指標(biāo)。

1.2.2檢測方法采用流式細(xì)胞術(shù)檢測紅細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度,以I-STAT1-Analyzer測定血漿游離鈣濃度,以化學(xué)比色法檢測紅細(xì)胞膜上Ca2+-Mg2+-ATPase活性。

1.2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。各組間均數(shù)的兩兩比較用LSD法。各變量間關(guān)系作直線相關(guān)分析。以P<0.05為差異有顯著性。全部資料均采用SPSS12.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2結(jié)果

2.1紅細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度(見表2)。

表2

HIE各組與對照組紅細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度

(相對熒光強(qiáng)度)

組別例數(shù)紅細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度(相對熒光強(qiáng)度)

輕度HIE組30114.98±29.25

中度HIE組30320.86±33.61

重度HIE組22443.13±40.12

對照組30106.39±26.65

注:表示與輕度組比較P<0.05;表示與對照組比較P<0.05

2.2血漿游離鈣濃度(見表3)。

表3

HIE各組與對照組血漿游離鈣(mmol/L)

組別例數(shù)血漿游離鈣(mmol/L)

輕度HIE組300.95±0.24

中度HIE組300.76±0.13

重度HIE組220.61±0.11

對照組300.96±0.19

注:表示與輕度組比較P<0.05;表示與對照組比較P<0.05

2.3紅細(xì)胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase活性(見表4)。

表4

HIE各組與對照組紅細(xì)胞膜Ca2+-Mg2+-ATP

酶活性(μmolPi/mgprot/hour)

組別例數(shù)紅細(xì)胞膜Ca2+-Mg2+-ATP酶活性(μmolPi/mgprot/hour)

輕度HIE組300.70±0.11

中度HIE組300.50±0.11

重度HIE組220.40±0.14

對照組300.65±0.10

注:表示與輕度組比較P<0.05;表示與對照組比較P<0.05

2.4相關(guān)性研究

2.4.1中度和重度HIE組紅細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度與紅細(xì)胞膜Ca2+-Mg2+-ATP酶活性呈負(fù)相關(guān),(r=-0.684,r=-0.772,P<0.05)。

2.4.2中度和重度HIE組紅細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度與血漿游離鈣呈負(fù)相關(guān),(r=-0.574,r=-0.740,P<0.05)。

2.4.3中度和重度HIE組紅細(xì)胞膜Ca2+-Mg2+-ATP酶活性與血漿游離鈣呈正相關(guān)(r=0.505,r=0.534,P<0.05)。

2.5補(bǔ)充鈣劑前后紅細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度比較(見表5)。

表5

補(bǔ)充鈣劑前后紅細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度(x±s)

組別例數(shù)

熒光強(qiáng)度

補(bǔ)充鈣劑前補(bǔ)充鈣劑后/常規(guī)治療后

HIE補(bǔ)充鈣劑組20366.43±78.36①201.00±60.22②

HIE未補(bǔ)充鈣劑組10374.24±86.45③226.42±79.26④

注:②與①比較t=7.4861P<0.05;③與①比較t=0.2488P>0.05;②與④比較t=0.9806P>0.05

2.6補(bǔ)充鈣劑前后血漿游離鈣(見表6)。

表6

補(bǔ)充鈣劑前后血漿游離鈣(x±smmol/L)

組別例數(shù)

iCa2+(mmol/L)

補(bǔ)充鈣劑前補(bǔ)充鈣劑后/常規(guī)治療后

HIE補(bǔ)充鈣劑組200.62±0.16①0.89±0.12②

HIE未補(bǔ)充鈣劑組100.57±0.14③0.75±0.11④

注:②與①比較t=7.3943P<0.05;③與①比較t=0.8391P>0.05;②與④比較t=3.0928P<0.05

2.7補(bǔ)充鈣劑前后紅細(xì)胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase活性(見表7)。

表7

補(bǔ)充鈣劑前后紅細(xì)胞膜Ca2+-Mg2+-ATPase

活性(x±sμmolPi/mgprot/hour)

組別例數(shù)

Ca2+-Mg2+-ATPase

補(bǔ)充鈣劑前補(bǔ)充鈣劑后/常規(guī)治療后

HIE補(bǔ)充鈣劑組200.20±0.04①0.40±0.06②

HIE未補(bǔ)充鈣劑組100.18±0.07③0.37±0.05④

注:②與①比較方差不齊采用t′檢驗(yàn)P<0.05;③與①比較方差不齊采用t′檢驗(yàn)P>0.05;②與④比較方差齊t=1.3595P>0.05

3討論

自90年代以來,新生兒缺氧缺血性腦病一直是國內(nèi)新生兒醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn),但至今對于重癥患兒尚缺乏有效的治療方法。目前鈣與新生兒缺氧缺血性腦病的關(guān)系已經(jīng)得到公認(rèn),1977年Nicholson第一次提出鈣介導(dǎo)缺氧缺血后神經(jīng)元死亡的學(xué)說,自此關(guān)于鈣的各方面研究不斷有新的突破[3,4]。

在正常情況下,Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)信使,幾乎參與一切調(diào)控細(xì)胞功能的信息轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,也是參與細(xì)胞內(nèi)代謝活動(dòng)的重要元素,細(xì)胞內(nèi)Ca2+的穩(wěn)定的維持對于生命活動(dòng)是至關(guān)重要的,維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+的穩(wěn)定的機(jī)制:①細(xì)胞膜上Ca2+-Mg2+-ATPase的外排作用;②內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對Ca2+的儲(chǔ)存;③線粒體對Ca2+的儲(chǔ)存;④胞漿中一些蛋白質(zhì)與陰離子和Ca2+結(jié)合;⑤胞漿膜內(nèi)側(cè)磷脂極性端也具有和Ca2+結(jié)合的能力[5,6]。

局部或全部腦缺血后數(shù)分鐘,神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的游離鈣[iCa2+]即明顯升高,其主要機(jī)制為:①通過興奮性氨基酸受體(excitatoryaminoacidreceptor,EAAR)造成Ca2+內(nèi)流;②內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體儲(chǔ)存的Ca2+釋放;目前認(rèn)為N-甲基-D-天門冬氨酸鹽受體(N-Methyl-D-asparaticacid,NMDA)的過度激活是缺血后細(xì)胞內(nèi)iCa2+迅速升高的主要因素,而持續(xù)iCa2+升高是線粒體Ca2+釋放的結(jié)果。另外,缺氧使H+含量增多,細(xì)胞酸中毒,結(jié)合鈣成為游離鈣也加劇了胞漿內(nèi)游離鈣含量增加。

細(xì)胞內(nèi)游離鈣增加通過激活細(xì)胞內(nèi)一系列Ca2+依賴性生物化學(xué)過程和導(dǎo)致線粒體滲透性改變及功能障礙而造成細(xì)胞損害和死亡,在新生兒HIE的研究中,由于取材的限制而無法直接觀察和測定腦細(xì)胞中鈣的變化。紅細(xì)胞是血液中含量最多的細(xì)胞成分,成熟的紅細(xì)胞無核,胞漿Ca2+濃度的變化可以較好地反映細(xì)胞內(nèi)外Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)情況,非常適用于機(jī)體細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)變化機(jī)制及病理生理的研究。

本研究結(jié)果顯示中重度HIE組急性期血漿游離鈣濃度低于非HIE組;而紅細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度則高于非HIE組;同時(shí),紅細(xì)胞膜上Ca2+-Mg2+-ATPase活性明顯低于非HIE組,三項(xiàng)指標(biāo)中重度HIE急性期與非HIE組比較均為P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且病情越重,變化越大,此與以往的一些研究一致[7],提示血漿游離鈣可作為早期判斷HIE腦損傷程度的有效指標(biāo)[8]。

本研究還顯示,HIE補(bǔ)充鈣劑組在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上均給予補(bǔ)充鈣劑治療10%葡萄糖酸鈣2ml/kg+10%葡萄糖注射液10ml,2次/d,靜脈滴注,連續(xù)不超過3d,患兒驚厥、呼吸障礙等癥狀明顯緩解或消失,而未補(bǔ)充鈣劑組的這些癥狀仍然存在,再次測定各相關(guān)指標(biāo),其結(jié)果顯示補(bǔ)充鈣劑組血漿游離鈣濃度較補(bǔ)充前明顯上升,基本恢復(fù)正常;紅細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度較補(bǔ)充前有所下降,但與未補(bǔ)充鈣劑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與此同時(shí),紅細(xì)胞膜上Ca2+-Mg2+-ATPase活性較補(bǔ)充前明顯恢復(fù),已基本恢復(fù)正常,但與未補(bǔ)充鈣劑組比較亦差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果提示了補(bǔ)充鈣劑后血漿游離鈣濃度上升,而細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度并未明顯上升,說明補(bǔ)充鈣劑并未加重細(xì)胞內(nèi)鈣超載,這就為臨床補(bǔ)充鈣劑提出了一定的可行性依據(jù),在臨床中HIE常出現(xiàn)低鈣血癥加重驚厥、呼吸障礙等癥狀,如不及時(shí)予以緩解會(huì)進(jìn)一步加重腦損傷,甚至導(dǎo)致生命危險(xiǎn)[9],適當(dāng)補(bǔ)充鈣劑即10%葡萄糖酸鈣2ml/kg+10%葡萄糖注射液10ml,2次/d,靜脈滴注,連續(xù)不超過3d,在臨床上是可行的,可有效緩解上述癥狀,但另一方面,由于本研究觀察時(shí)間較短,在補(bǔ)充鈣劑后是否會(huì)延長細(xì)胞內(nèi)鈣超載的持續(xù)時(shí)間仍有待于進(jìn)一步的研究,有鑒于此,認(rèn)為臨床上只要驚厥、呼吸障礙等癥狀緩解后即可停止鈣劑的補(bǔ)充,血漿游離鈣僅做為參考。

總之,HIE時(shí)易造成細(xì)胞內(nèi)外電解質(zhì)的紊亂,尤其鈣離子的紊亂不僅常見而且進(jìn)一步加重抽搐、呼吸障礙等從而加重腦損傷成為導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的因素之一,當(dāng)臨床上出現(xiàn)低鈣血癥時(shí)提倡個(gè)性化治療,在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上根據(jù)臨床癥狀的不同而處理對策有所不同,當(dāng)血漿游離鈣明顯降低且同時(shí)出現(xiàn)驚厥、呼吸障礙、尿潴留等癥狀時(shí),補(bǔ)充鈣劑并非絕不可取,而一旦臨床癥狀緩解即可停用鈣劑臨床觀察,血漿游離鈣水平僅作為參考;在HIE的治療方面鈣通道阻滯劑、亞低溫等的應(yīng)用亦有待于進(jìn)一步的研究與探討。

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