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本文作者：張鳳春1,2，南飛飛1，徐海燕1，王紅霞3，唐雷3，馬越3，徐迎春3作者單位：1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬蘇州九龍醫(yī)院腫瘤科2海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院腫瘤科3上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院腫瘤科

原代乳腺癌細(xì)胞微球體的特征

結(jié)果顯示，2組的細(xì)胞密度和微球體大小均十分相似，提示采用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)法可以從乳腺癌組織中成功培養(yǎng)獲得乳腺癌細(xì)胞微球體（圖1）。45例乳腺癌組織標(biāo)本中，共有12例獲得原代乳腺癌細(xì)胞微球體，其中8例（66.70%）病理分級(jí)為Ⅲ級(jí)、4例（33.30%）為Ⅱ級(jí)。根據(jù)ER、PR和HER-2的表達(dá)情況對(duì)這12例患者進(jìn)行分型：luminalA型9例，luminalB型1例，ER、PR和HER-2三陰性2例。培養(yǎng)至第7～10天，可觀察到原代乳腺癌細(xì)胞微球體的形成，此后微球體逐漸增大，數(shù)目逐漸增多；培養(yǎng)至第14天時(shí)，微球體趨于穩(wěn)定，直徑可達(dá)100μm。12例患者中，2例的微球體形成率為6.0‰，2例為7.0‰，1例為9.0‰，3例為10.0‰，以及11.0‰、12.0‰和13.0‰和15.0‰各1例；平均微球體形成率為（9.67±2.84）‰。

原代乳腺癌細(xì)胞微球體干細(xì)胞樣表型特征的鑒定

在獲得乳腺癌組織來源的原代乳腺癌細(xì)胞微球體細(xì)胞后，采用FCM分析其微球體細(xì)胞中CD44和CD24的表達(dá)情況，結(jié)果顯示微球體細(xì)胞表現(xiàn)出CD44＋/CD24low/－的特征，且CD44＋/CD24low/－表型細(xì)胞所占百分率（24.71%）明顯高于原代乳腺癌細(xì)胞的1.30%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2A）。對(duì)原代乳腺癌細(xì)胞微球體細(xì)胞進(jìn)行了干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)量的測(cè)定。RFQ-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，原代乳腺癌細(xì)胞微球體細(xì)胞中SOX2、Nanog、KLF4、OCT-4和MDR1mRNA的表

乳腺癌組織來源的原代乳腺癌細(xì)胞微球體形成率與臨床病理特征之間的關(guān)系

bcsc是乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源，BCSC對(duì)化療和放療均表現(xiàn)出明顯的耐藥，可能直接影響乳腺癌患者的無病生存期和總生存期。因此，根據(jù)是否形成原代乳腺癌細(xì)胞微球體進(jìn)行分組，并分析了微球體形成與患者臨床病理特征之間的關(guān)系。研究結(jié)果顯示，12例獲得原代乳腺癌細(xì)胞微球體，其微球體形成與絕經(jīng)情況、組織學(xué)分級(jí)、PR狀態(tài)、HER-2狀態(tài)和腫瘤復(fù)發(fā)明顯相關(guān)（P＜0.05，表1），與患者的發(fā)病年齡和初潮年齡也具有一定的相關(guān)性（P＜0.05，表1）。生存分析顯示，微球體形成與否與DFS和OS無明顯相關(guān)性（P＞0.05，表1）進(jìn)一步按照平均微球體形成率，將12例患者分為微球體高形成率組（≥9.0‰）和微球體低形成率組（＜9.0‰），未發(fā)現(xiàn)其與患者的臨床病理特征及分子分型之間存在相關(guān)性，推測(cè)可能與本組病例數(shù)較少有關(guān)（表3）。

近年來的大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞系中存在著不同分化階段的細(xì)胞，其中只有極少量的腫瘤細(xì)胞充當(dāng)干細(xì)胞的角色，具有自我更新和多向分化的潛能，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵性的作用，這些細(xì)胞被稱之為腫瘤干細(xì)胞[1]。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)法是利用干細(xì)胞能夠在富含生長(zhǎng)因子的無血清培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng)并形成微球體的特性以富集干細(xì)胞。最早由Dontu等[2]和Ponti等[5]采用該方法分別從人乳腺組織和人乳腺癌組織來源的細(xì)胞中培養(yǎng)獲得微球體，此后便廣泛應(yīng)用于乳腺癌細(xì)胞系來源的腫瘤干細(xì)胞的富集[6]。然而，對(duì)于乳腺癌組織來源的原代BCSC的研究[7,8]卻很少。

本研究選擇45例乳腺癌患者的乳腺癌組織，參照乳腺癌細(xì)胞系MCF-7來源干細(xì)胞的體外培養(yǎng)條件，采用無血清培養(yǎng)方式和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)形成乳腺癌細(xì)胞微球體的方法，獲得12例患者乳腺癌組織來源的原代乳腺癌細(xì)胞微球體。由于原代乳腺癌細(xì)胞微球體的培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，因此微球體形成率較低，平均僅為（9.67±2.84）‰，較乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的微球體形成率低。推測(cè)可能與如下因素有關(guān)：從乳腺癌組織中分離乳腺癌細(xì)胞時(shí)所采用的機(jī)械和化學(xué)消化對(duì)細(xì)胞可能產(chǎn)生一定的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞活性下降；體外培養(yǎng)環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境不同，從體內(nèi)分離得到的細(xì)胞需要一段適應(yīng)期才能適應(yīng)體外培養(yǎng)環(huán)境；不同組織學(xué)類型的乳腺癌組織中干細(xì)胞的數(shù)量不同。

本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織來源的原代乳腺癌細(xì)胞微球體細(xì)胞中的CD44＋/CD24low/－表型細(xì)胞所占百分率高于原代乳腺癌細(xì)胞（分別為24.71%和1.30%，P＜0.05），提示原代乳腺癌細(xì)胞微球體富集了BCSC樣表型細(xì)胞。干細(xì)胞相關(guān)基因Nanog、OCT-4、SOX2和KLF4都是維持胚胎干細(xì)胞自我更新以及多能性轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的核心轉(zhuǎn)錄因子[9-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織來源的原代乳腺癌細(xì)胞微球體細(xì)胞均表達(dá)SOX2、KLF4、Nanog和OCT-4mRNA，且表達(dá)量明顯高于原代乳腺癌細(xì)胞（P＜0.05），表明前者具有干細(xì)胞樣基因表達(dá)特征。本研究還發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織來源的原代乳腺癌細(xì)胞微球體細(xì)胞表達(dá)MDR1mRNA，提示其對(duì)化療藥物的敏感性較差，因此應(yīng)選擇其他有效的治療方法進(jìn)行干預(yù)。乳腺癌臨床病理特征和分子分型與治療選擇及預(yù)后相關(guān)，但對(duì)于原代BCSC數(shù)是否會(huì)影響預(yù)后尚無定論。Idowu等[13]采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了50例乳腺癌組織CD44＋/CD24low/－的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)三陰性乳腺癌中CD44＋/CD24low/－表型細(xì)胞所占百分率較高。李媛[14]報(bào)道，CD44＋/CD24low/－細(xì)胞所占百分率較高者更易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，特別是骨轉(zhuǎn)移。田允鴻等[15]檢測(cè)了87例乳腺癌組織來源的CD44＋/CD24low/－腫瘤干細(xì)胞的平均含量，結(jié)果顯示ER和PR與腫瘤干細(xì)胞含量及能否成功形成球囊明顯相關(guān)，而HER-2、年齡和T分期等與腫瘤干細(xì)胞含量及能否成功形成球囊無明顯相關(guān)性。本研究中，按照平均微球體形成率將患者分成微球體高形成率組（≥9.0‰）和微球體低形成率組（＜9.0‰），結(jié)果未發(fā)現(xiàn)微球體形成率與臨床病理特征和分子分型之間存在相關(guān)性，推測(cè)可能與本組病例數(shù)較少有關(guān)。12例獲得原代乳腺癌細(xì)胞微球體，其微球體形成率與絕經(jīng)情況、組織學(xué)分級(jí)、PR狀態(tài)、HER-2狀態(tài)和腫瘤復(fù)發(fā)明顯相關(guān)（P＜0.05），與患者的發(fā)病年齡和初潮年齡也具有一定的相關(guān)性（P＜0.05）。這些結(jié)果均提示，原代乳腺癌細(xì)胞微球體數(shù)量可能成為重要的療效及預(yù)后判斷指標(biāo)。今后有必要開展長(zhǎng)期的隨訪研究，同時(shí)擴(kuò)大樣本量以進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

乳腺癌作為實(shí)體腫瘤，其干細(xì)胞的純化十分困難，一方面是由于原代BCSC數(shù)量非常少，另一方面也是因?yàn)槿鄙倜鞔_的干細(xì)胞表面標(biāo)志物。因此，尋找能夠有效分離并富集原代BCSC的新方法仍然是BCSC研究中亟待解決的問題。本研究利用獲自于乳腺癌患者腫瘤組織的乳腺癌細(xì)胞，在無血清的干細(xì)胞培養(yǎng)條件下獲得原代乳腺癌細(xì)胞微球體，這些微球體細(xì)胞高表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)基因，并具有自我更新和增殖能力，提示其含有相對(duì)較多的腫瘤干細(xì)胞樣表型細(xì)胞，且與患者的部分臨床病理特征相關(guān)，可能為未來以乳腺癌患者腫瘤組織來源的BCSC為靶點(diǎn)的研究以及乳腺癌預(yù)后的判斷提供參考依據(jù)。