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微生物多樣性分析范文第1篇

【關(guān)鍵詞】環(huán)境工程;DGGE技術(shù);廢水生物處理

1.新技術(shù)在環(huán)境工程生物處理研究中的應(yīng)用

由于PCR-DGGE技術(shù)克服了傳統(tǒng)微生物學(xué)方法的局限性，自Muvzer等開辟了DGGE在微生物生態(tài)領(lǐng)域研究的先河以來，該技術(shù)迅速發(fā)展成為環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)分析研究的主要手段之一。近年來，DGGE 用于環(huán)境微生物種群的研究越來越多，涉及的領(lǐng)域也越來越廣泛，在國外DGGE技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于活性污泥、生物膜等生物處理系統(tǒng)中的微生物多樣性檢測、微生物鑒定以及種群演替等方面的研究，在國內(nèi)這方面的應(yīng)用雖然處于起步階段，但也成為研究的熱點(diǎn)。

1．1在廢水生物處理研究中的應(yīng)用

PCR-DGGE技術(shù)在廢水生物處理研究中的應(yīng)用使人們對廢水處理過程中微生物群落的變化產(chǎn)生了新的認(rèn)識。

Lapara等研究了升高溫度對廢水好氧生物處理過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能的影響，DGGE分析細(xì)菌群落的結(jié)果表示不同溫度下有不同的細(xì)菌群落。

應(yīng)用PCR-DGGE方法，對在相同的操作條件下分別用低溫菌和常溫菌接種的兩套活性污泥系統(tǒng)中的微生物群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化進(jìn)行了追蹤。由于工藝相同，使得接種的低溫菌群和常溫菌群在相同的操作條件下，產(chǎn)生了相似的微生物群落結(jié)構(gòu)。隨著運(yùn)行時(shí)間的增加，其菌群結(jié)構(gòu)相似程度也越來越高。

硝化作用是廢水處理系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)氨氮去除的關(guān)鍵步驟。而氨氧化細(xì)菌在硝化作用過程中負(fù)責(zé)將氨氧化為亞硝酸鹽，實(shí)現(xiàn)亞硝化作用，是硝化過程中必不可少的步驟。但由于氨氧化細(xì)菌的生長速率相當(dāng)?shù)?，生物量很少，采用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)分析法研究氨氧化細(xì)菌相當(dāng)費(fèi)時(shí)、繁瑣。許玫英等采用PCR擴(kuò)增16SrDNA、擴(kuò)增功能基因、隨機(jī)克隆測序等技術(shù)，分析處理含高濃度氨氮廢水處理系統(tǒng)不同馴化時(shí)期的4個(gè)活性污泥樣品氨氧化細(xì)菌的種類和氨單加氧酶的活性，并在國內(nèi)首次采用PCR-DGGE相結(jié)合的技術(shù)對樣品中總的細(xì)菌類群的差異進(jìn)行研究。結(jié)果表明采用PCR-DGGE技術(shù)有利于更全面地了解氨氧化細(xì)菌的類群和功能，進(jìn)而改善廢水處理系統(tǒng)的處理效果。

應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)對城市污水化學(xué)一生物絮凝強(qiáng)化一級處理工藝與傳統(tǒng)的完全混合式處理工藝反應(yīng)池活性污泥樣品微生物種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了對比研究，對同一反應(yīng)器不同位置微生物分布以及不同工況下的微生物種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步探討。結(jié)果表明兩種城市污水處理工藝中微生物種群多樣性都相當(dāng)豐富，但是種群結(jié)構(gòu)相差很大。說明化學(xué)生物絮凝處理工藝的微生物作用與成分相近的城市污水處理工藝中微生物作用機(jī)理可能存在相當(dāng)大的差別。

R0wan等采用生物滴濾反應(yīng)器和生物濾池處理同種廢水，運(yùn)用PCR-DGGE考察了不同反應(yīng)器中的氨氧化細(xì)菌菌群的組成。雖然不同形式反應(yīng)器或是同一反應(yīng)器的不同位置中的氨氧化細(xì)菌菌群組成不同，但是主要種群是不依賴反應(yīng)器的形式或是在反應(yīng)器中所處的位置不同而改變的，也正是這些主要種群在整個(gè)處理過程中發(fā)揮著重要的作用。

采用PcR-DGGE技術(shù)對處理采油廢水的水解酸化一缺氧法不同生物反應(yīng)器中污泥樣品進(jìn)行研究，確定了微生物的優(yōu)勢菌種，并進(jìn)行了多樣性分析，結(jié)果顯示了在不同環(huán)境條件下微生物群落結(jié)構(gòu)的連續(xù)動態(tài)變化過程。

1．2 在廢氣生物處理研究中的應(yīng)用

生物過濾是一種能有效處理惡臭和揮發(fā)性有機(jī)廢氣的氣體污染控制技術(shù)。生物濾池和生物濾塔作為生物處理惡臭氣體的簡單有效的方法，得到了快速的發(fā)展。

采用PCR-DGGE技術(shù)研究除臭生物濾池中試裝置中分別一處于較強(qiáng)酸性和中性的兩種不同運(yùn)行環(huán)境下微生物種群的多樣性和生物種群的結(jié)構(gòu)變化。通過擴(kuò)增細(xì)菌16SrRNA基因的V3可變區(qū)，結(jié)合應(yīng)用DGGE技術(shù)分析除臭生物濾池的生物種群的結(jié)構(gòu)變化，并回收主要的DN段，結(jié)合PCR測序及T載體克隆測序，明確優(yōu)勢菌群的系統(tǒng)發(fā)育地位。結(jié)果表明，除臭生物濾池在不同的口H條件下，微生物的多樣性及其豐度存在較大差別，強(qiáng)酸性對微生物具有較高的選擇作用，與中性條件相比 微生物種群多樣性相對較低。同時(shí)在濾池的不同層次上也表現(xiàn)出明顯的空間分布多樣性差異，序列比對結(jié)果顯示硫氧化細(xì)菌在除臭過程中占有優(yōu)勢地位。為更好地處理惡臭氣體提供可靠的科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為生物除臭的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

生物濾塔中微生物的種群結(jié)構(gòu)以及微生物多樣性對于惡臭氣體的處理效率以及反應(yīng)器的穩(wěn)定運(yùn)行至關(guān)重要。殷峻等應(yīng)用DGGE技術(shù)對處理含氨廢氣的生物濾塔中微生物多樣性隨時(shí)間的變化進(jìn)行了研究，通過比較反應(yīng)器不同填料、不同時(shí)期微生物多樣性得出結(jié)論：填料中微生物的多樣性都隨著反應(yīng)器運(yùn)行時(shí)間的延長而有所減少；與污泥填料和混合填料相比，堆肥填料的微生物多樣性程度最高，反應(yīng)器的去除能力也最好。

1．3 在污泥生物處理研究中的應(yīng)用

在污泥處理過程中，污泥的穩(wěn)定化是…個(gè)相當(dāng)重要的過程。微生物的穩(wěn)定化過程對于系統(tǒng)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)具有更直接的指導(dǎo)意義。傅以鋼等用DGGE指紋圖譜技術(shù)對污泥堆肥工藝中的細(xì)菌種群動態(tài)變化及多樣性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，生物法污泥堆肥周期小于8d。對污泥堆肥各工藝環(huán)節(jié)樣品進(jìn)行DGGE指紋圖譜和相似性系數(shù)Cs值分析，發(fā)現(xiàn)隨著反應(yīng)的持續(xù)進(jìn)行，微生態(tài)結(jié)構(gòu)的Cs值越來越高，說明微生物種群結(jié)構(gòu)愈趨穩(wěn)定。證實(shí)污泥微生態(tài)能迅速進(jìn)行優(yōu)勝劣汰的篩選，調(diào)整內(nèi)部細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)，從而達(dá)至 適應(yīng)環(huán)境的目的，在發(fā)酵過程中形成的優(yōu)勢細(xì)菌種群能長時(shí)間保持穩(wěn)定。

2.技術(shù)的原理

微生物多樣性分析范文第2篇

關(guān)鍵詞：土壤微生物；多樣性；DNA；提取技術(shù)

中圖分類號：S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）23-5253-06

Advances of Total DNA Extraction Technology for Soil Microbial Diversity Research

XIAO Bin，JIANG Dai-hua，LIU Li-long，LIU Quan-dong

（College of Agronomy，Guangxi University，Nanning 530005，China）

Abstract： The influencing factors and application aspects， as well as the potentials and limitations of DNA extraction techniques for microbial diversity analysis were reviewed. Applying appropriate methods to extract microorganism DNA fragment that have right purity and appropriate size from soil were the precondition in soil microbial study on the molecular level， and the subsequent molecular biotechnology operations were all rely on these methods.

Key words： soil microorganism； diversity； DNA； extraction method

土壤微生物多樣性是生物多樣性研究的一個(gè)重要領(lǐng)域，是指其在遺傳、種類、結(jié)構(gòu)與生態(tài)功能方面的變化，對指示土壤微生物群落的穩(wěn)定性，在保持土壤質(zhì)量和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性等方面具有重要意義[1]，是當(dāng)今國內(nèi)外關(guān)注和研究的熱點(diǎn)問題之一。

長期以來，由于研究方法的限制，傳統(tǒng)的分離純化培養(yǎng)技術(shù)僅能獲得土壤中微生物總種群數(shù)的1%左右，而絕大部分微生物目前還不能獲得純培養(yǎng)[2]，未能獲得純培養(yǎng)的微生物才是土壤微生物的主體，因此，有關(guān)微生物多樣性研究進(jìn)展不大。

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和研究手段的更新，基于土壤微生物群落總DNA的現(xiàn)代微生物分子生態(tài)學(xué)研究方法避免了傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法的缺點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、功能以及動態(tài)監(jiān)測研究[3]。因此作為微生物群落分子分析方法的基礎(chǔ)，最重要的一步就是從土壤樣品中盡量毫無偏差地提取出高質(zhì)量的、具有代表性的微生物總基因組DNA。關(guān)于土壤微生物DNA提取方法的報(bào)道很多[4，5]，然而這些方法主要側(cè)重于土壤中的細(xì)菌群落，很少關(guān)注土壤中真菌群落總基因組DNA的提取方法及其提取效果。另外，細(xì)胞裂解不完全、DNA分子吸附在樣品基質(zhì)顆粒的表面、從樣品中同時(shí)提取了某些重要酶的活性抑制劑、DNA分子的損耗、降解和破壞等因素也影響著土壤微生物DNA提取的質(zhì)量，因而提取土壤微生物總DNA在研究中尤為重要[6]。本文主要對DNA提取過程中的主要影響因素、現(xiàn)行各方法的優(yōu)缺點(diǎn)以及存在的問題作一綜述。

1 基于DNA方法的土壤微生物多樣性研究現(xiàn)狀

傳統(tǒng)微生物學(xué)研究方法主要依賴于純培養(yǎng)技術(shù)和顯微鏡技術(shù)，對土壤微生物多樣性的描述與研究存在一定的局限性。20世紀(jì)中后期，隨著土壤微生物多樣性研究向多方面發(fā)展，人們嘗試著利用分析微生物細(xì)胞中某種指示成分，如磷脂脂肪酸（PLFA）來研究土壤微生物的種群組成，但是這些方法的缺陷是無法保證細(xì)胞中某種指示成分在土壤中的穩(wěn)定性，并且如果某種微生物的PLFA是未知的，則該不可培養(yǎng)微生物仍難以鑒別[7，8]。

1980年，Torsvik等[9]首次建立了從土壤樣品中直接提取細(xì)菌DNA的方法，并于1990年將其成功應(yīng)用于DNA雜交技術(shù)，研究發(fā)現(xiàn)1 g土壤中有4 000個(gè)以上不同的細(xì)菌種類，說明土壤中微生物多樣性是極其豐富的。后來研究者發(fā)現(xiàn)16S rDNA在原核微生物中普遍存在，并且含有相對保守和可變區(qū)域，在不同的個(gè)體間16S rDNA基因序列也不會進(jìn)行基因交換，因此，每一種生物都有自己的獨(dú)特序列。1986年，Pace[3]第一次以16S rDNA為基礎(chǔ)確定環(huán)境樣品中的微生物，使人們對大量不可培養(yǎng)微生物群體有了全新的認(rèn)識。此后，基于16S rDNA基因的指紋圖譜分析的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)得到迅速發(fā)展，包括限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性分析（RAPD）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）、基因芯片（Microarray）、PCR-DGGE/TGGE 等，為全面揭示土壤微生物種群結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性提供了重要手段。其總的技術(shù)路線：分離微生物基因組DNA，用特異性引物擴(kuò)增16S rRNA基因片段，再將該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行更深一步分析，從而可在種、屬的水平上研究不同生境中的微生物種群結(jié)構(gòu)及其動態(tài)變化[10]。

2 土壤微生物總DNA的提取

從土壤樣品中提取DNA的方法大致可分為2類，即間接提取法和直接提取法。間接提取法首先是對土壤樣品進(jìn)行反復(fù)懸浮和離心，去除土壤等雜質(zhì)，提取土壤微生物細(xì)胞，再采用酶裂解細(xì)胞提取微生物總DNA。直接裂解法是不去除土壤等雜質(zhì)，而是通過物理的、化學(xué)的、酶解等手段相結(jié)合，直接裂解土壤中的微生物細(xì)胞，使其釋放DNA，再進(jìn)行提取和純化。但不論采用何種方法，都存在一定的缺陷，要想提取較完整的DNA需要具備以下幾個(gè)條件： ①土壤微生物能從土壤中充分釋放，尤其是那些緊緊吸附在土壤顆粒，甚至深藏于土壤微穴中的細(xì)菌等相對比較難分離的微生物。②對一些比較頑固的微生物，如革蘭氏陽性菌、孢子和小細(xì)菌的裂解，需要更劇烈的處理，而這又會造成對裂解敏感的細(xì)菌DNA折斷。③采集土壤樣品后應(yīng)盡快提取DNA，因?yàn)橥寥涝? ℃儲藏幾周就會造成大分子DNA的降解。

2.1 間接提取土壤微生物總DNA

Torsvik等[11]最先報(bào)道了從土壤中提取微生物DNA的間接法，包括以下4個(gè)步驟：①分散土壤；②土壤微生物的提?。ǚ蛛x細(xì)胞與土壤）；③土壤微生物的純化；④細(xì)胞裂解及DNA純化。

2.1.1 土壤分散 土壤微生物一般與土壤顆粒結(jié)合，包藏在土壤團(tuán)聚體內(nèi)，因此，最大限度地分散土壤是從土壤中分離提取微生物的關(guān)鍵。通常采用物理或化學(xué)法，或是二者相結(jié)合以達(dá)到微生物與土粒分離的目的。常用的物理分散技術(shù)是使用玻璃珠與土壤懸液一起振蕩，或是使用韋林氏攪拌器（勻漿器、轉(zhuǎn)子混合器）攪拌分散，或是使用超聲波分散土壤團(tuán)聚體等。而化學(xué)分散法是通過加入化學(xué)分散劑以達(dá)到促進(jìn)微生物與土粒分離的目的。最常用的分散劑為0.2%焦磷酸鈉，其他還有Winogradsky鹽溶液、Tris緩沖液、生理鹽水、六偏磷酸鈉、膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、純水等[26]。值得注意的是，為有效地分散土壤，分散劑的種類、濃度、加入量、機(jī)械作用（振蕩、攪拌和超聲波等）的方式、時(shí)間以及容器的大小等均應(yīng)加以考慮。還可以將化學(xué)試劑與機(jī)械方法結(jié)合來懸浮土壤顆粒。研究發(fā)現(xiàn)Chelex100就是一種有效的土壤顆粒懸浮劑。各種分散方法分散效果不同，采用何種分散方法效果最佳目前尚無一致結(jié)論，而且防止細(xì)胞因物理、化學(xué)作用導(dǎo)致破裂提前釋放DNA很重要，處理不當(dāng)會使DNA降解。常用分離提取土壤微生物的土壤分散方法列入表1。

2.1.2 土壤微生物的提取 土壤微生物的提取通常采用離心分離法，既要使微生物與土壤顆粒分離，又要保證基本不破壞微生物細(xì)胞。由于土壤中細(xì)菌的平均密度（1.1 μg/cm3）遠(yuǎn)小于土壤礦物質(zhì)的平均密度（2.6 μg/cm3），因此采用離心或淘選法可使細(xì)菌與土壤顆粒得到較好的分離。Hopkins等[17]采用密度逐級離心法分離出60%以上的土壤細(xì)菌。此外，也有學(xué)者提出用過濾法，即將土壤樣品分散處理后，經(jīng)20 μm或30 μm微孔篩真空抽濾，其濾液中即可能含有絕大多數(shù)土壤細(xì)菌，此過程操作簡便，提取液中土壤殘留物少，易于純化。

由于土壤中的真菌、放線菌主要以菌絲的形態(tài)與土壤顆粒纏繞在一起以及細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的特殊性，從土壤樣品中分離提取真菌放線菌要比提取單細(xì)胞的細(xì)菌相對困難。迄今為止，國內(nèi)外有關(guān)分離提取真菌的研究文獻(xiàn)極少，且這些報(bào)道方法所提取的真菌菌絲只占真菌總生物量的極少部分。Vilarino等[21]在前人研究的基礎(chǔ)上提出了分離土壤真菌的原理：新鮮土壤經(jīng)分散后，土壤懸浮液中的菌絲可附著在慢速轉(zhuǎn)動的銅絲（直徑150 μm）框上，洗脫后即得提取的土壤真菌。潘力等[22]以曲霉菌為例，采用微波處理菌絲并置于10× TE Buffer中即可得到DNA，建立了一種快速提取絲狀真菌DNA的實(shí)驗(yàn)方法，為高通量快速篩選絲狀真菌轉(zhuǎn)化子奠定了基礎(chǔ)。吳敏娜等[23]以傳統(tǒng)土壤總DNA提取方法及純菌DNA提取方法為基礎(chǔ)，分別與蝸牛酶、纖維素酶進(jìn)行組合、優(yōu)化，得到7種不同的土壤真菌基因組DNA提取方法。分離提取土壤細(xì)菌和真菌的流程如圖1所示。

2.1.3 土壤微生物的純化 目前常用兩相分離技術(shù)對上述土壤微生物提取液進(jìn)行純化。兩相分離技術(shù)最早為德國化學(xué)家Albertsson于20世紀(jì)50年代所建立，當(dāng)時(shí)主要用于生物大分子的分離。近些年該技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物工程等領(lǐng)域，是一種分離、純化生物大分子、細(xì)胞、病毒的方法，該技術(shù)也逐步發(fā)展成為一種溫和的生物分離方法，相對于原始的純化手段具有過程簡單、純化時(shí)間較短等特點(diǎn)，應(yīng)用領(lǐng)域廣泛[24]。關(guān)于其分離機(jī)制目前尚不完全清楚，有人認(rèn)為其分離的原理主要取決于不同組分的親水性差異，也有人認(rèn)為還與不同組分的電荷性質(zhì)差異有關(guān)。當(dāng)兩種互不相溶的聚合物以一定濃度溶于水中時(shí)，便可形成體積不同的兩相，被分離組分由于其與兩相的親和力不同，分別進(jìn)入不同相從而達(dá)到分離的目的。目前應(yīng)用最為廣泛的是PEG（聚乙二醇）/Dextran（葡聚糖）系統(tǒng)和PEG/無機(jī)鹽（磷酸鹽或硫酸鹽）系統(tǒng)。對于不同的兩相組分，分離時(shí)間不盡相同[25]。Smith等[19]研究了應(yīng)用兩相分離技術(shù)從土壤中分離純化非菌絲體微生物的效果，發(fā)現(xiàn)經(jīng)充分混合靜置一定時(shí)間后，即可形成上下兩層體積比約為4∶1的兩相分離系統(tǒng)，其中細(xì)菌主要富集在上層PEG相，土壤殘存顆粒將進(jìn)入下層Dextran相，經(jīng)4次提取純化，富集在上層PEG相的細(xì)菌總量約達(dá)加入兩相分離系統(tǒng)細(xì)菌總量的60%，而上層PEG相中的土壤礦質(zhì)顆?？偭績H占總加入量的4%以下。李妍等[26]用2%PEG+6%Dextran兩相分離技術(shù)（A2PP）純化細(xì)菌，測定細(xì)菌生物量，研究兩相分離技術(shù)在土壤微生物研究領(lǐng)域的可應(yīng)用性，結(jié)果表明采用0.1%膽酸鈉、鈉型離子交換樹脂、玻璃珠與土壤一起在4 ℃下振蕩2 h，能較好地分散、純化土壤細(xì)菌。研究表明，兩相分離技術(shù)同樣有可能用于分離純化土壤真菌。

2.2 直接提取土壤微生物總DNA

現(xiàn)今的土壤細(xì)菌DNA直接提取法是在Ogram等[27]建立的方法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，主要包括兩個(gè)步驟：①原位細(xì)胞裂解；②DNA提取和純化。

2.2.1 原位細(xì)胞裂解 直接裂解土壤微生物細(xì)胞的方法包括：機(jī)械破碎法、化學(xué)法、酶解法及3種手段相結(jié)合。機(jī)械破碎法常用的有凍融法、微波、超聲波法和玻璃微珠震蕩法；化學(xué)法常用表面活性劑SDS和SarkosyI、熱酚、高鹽、異硫氰酸胍等；酶解法：裂解酶、溶菌酶、蛋白酶K、鏈霉蛋白酶等。其中溶菌酶不僅可處理革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁，還可水解糖苷鍵和腐殖酸。2種或多種方法相結(jié)合對DNA的提取效果較好。王嘯波等[28]采用PBS緩沖液洗滌土壤樣品，結(jié)合SDS裂解微生物細(xì)胞的方法，同時(shí)提取2種土壤樣品的微生物DNA和RNA，結(jié)果表明該法提取的核酸不需要進(jìn)一步處理，其純度就可以滿足后續(xù)的分子生物學(xué)試驗(yàn)，從而避免了由于純化導(dǎo)致的核酸量的降低。熊開容等[29]采用凍融+玻璃珠+溶菌酶+SDS方法提取了活性污泥中微生物DNA，結(jié)果表明獲得的DNA適合于酶解和PCR擴(kuò)增要求。

值得關(guān)注的是，土壤中微生物種類繁多，生理狀態(tài)不同，革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌以及細(xì)菌與真菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和組成亦不相同。為了使提取的DNA具有代表性，就必須保證土壤樣品中所有微生物細(xì)胞裂解釋放出核酸，因此必須根據(jù)試驗(yàn)的性質(zhì)、要求選擇適當(dāng)裂解方法。研究表明，基于SDS的高鹽提取法會對一些革蘭氏陽性細(xì)菌效果不好。張瑞福等[30]采用凍融+溶菌酶+SDS方法提取3種芽孢桿菌（G+）DNA，結(jié)果表明經(jīng)凍融處理的霉?fàn)钛挎邨U菌均提取到了DNA，未經(jīng)凍融處理的霉?fàn)钛挎邨U菌未提取到DNA，且凍融處理未對DNA造成大的剪切，提取的DN段還大于23.1 kb。張穎慧等[31]使用優(yōu)化的CTAB法提取真菌基因組DNA。使用液氮凍融以及玻璃珠振蕩的方法代替了傳統(tǒng)的液氮研磨，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法所需菌體量少，且得到的基因組DNA比用傳統(tǒng)的CTAB法得到的基因組DNA產(chǎn)率高、純度好且步驟簡單，適用于一次微量提取多個(gè)樣品的基因組DNA，可用于大部分分子生物學(xué)基本實(shí)驗(yàn)如PCR和DNA的酶切等。

2.2.2 DNA提取和純化 在已報(bào)道的DNA提取和純化方法中，通常采用飽和酚或氯仿和蛋白酶處理，去除DNA樣品中的蛋白質(zhì)和部分RNA，然后對DNA進(jìn)行抽提，再用乙醇、異丙醇或聚乙二醇（PEG）沉淀后，經(jīng)羥基磷灰石柱或氯化銫密度梯度超速離心等進(jìn)一步純化。其他純化方法有聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）法、色譜法、電泳法、透析和過濾法、試劑盒法等。

Lamontagne等[32]研究結(jié)果表明PVP能夠與腐殖酸結(jié)合，起到有效去除提取的DNA中腐殖酸雜質(zhì)、提高DNA純度的作用。李靖宇等[33]采用氯化鈣-SDS-酶法對濕地土壤微生物DNA進(jìn)行提取，結(jié)果表明該方法能高效去除濕地土壤腐殖酸，純度較高，能直接滿足PCR擴(kuò)增。李鈞敏等[34]用含PVPP的緩沖液預(yù)洗DNA樣品，然后添加CaCl2和牛血清白蛋白可去除其中的腐殖酸，用PEG8000沉淀DNA，可提高DNA質(zhì)量，并證實(shí)這是一種簡便有效可直接應(yīng)用于PCR分析的土壤微生物總DNA的提取方法。蔡劉體等[35]采用 SDS-CTAB法提取煙草病圃土壤微生物總DNA，該方法既可達(dá)到裂解效果，還有助于去除腐殖酸，有利于提高所提取DNA 的質(zhì)量。吳紅萍等[36]采用酚氯仿和柱式腐殖酸去除劑對粗提取的土壤微生物DNA進(jìn)行純化后，可用于PCR擴(kuò)增，并以細(xì)菌16S rDNA基因引物可擴(kuò)增到相應(yīng)的片段。朱立成等[37]采用直接法提取土壤微生物總DNA，然后用Sephadex G-200凝膠離心層析法純化，可得到純度較高的DNA。段學(xué)軍等[38]采用稀釋模板及巢式PCR法很好地解決了在DNA提取純化過程中不能完全去除腐殖質(zhì)的問題。滕應(yīng)等[39]將BIO101 Systems公司研制的FastPrep多試管核酸提取系統(tǒng)與相應(yīng)的Fast DNA SPINKit for Soil試劑盒聯(lián)用，有效地提取了重金屬復(fù)合污染的農(nóng)田土壤微生物總DNA。

沒有哪種單一的純化步驟可以除去所有污染物，故許多研究者已經(jīng)將幾種純化步驟結(jié)合起來以期獲得最好的純化效果。Smalla等[40]將粗提的DNA進(jìn)行3步純化：①氯化銫密度梯度超速離心純化；②醋酸鉀沉淀；③Geneclean純化。發(fā)現(xiàn)經(jīng)前2步純化的DNA通過稀釋即可部分被限制性酶切和擴(kuò)增，但如不經(jīng)稀釋而進(jìn)行限制酶切和擴(kuò)增，則必需進(jìn)行最后一步純化。

2.2.3 直接法和間接法的比較 研究表明，直接法獲得的DNA較多，但不易去除抑制劑，間接法提取的DNA只占直接法的1/10，但分離的DNA純度較高，而且間接法得到的細(xì)菌量只占總菌群的25%～50%，直接法提得的DNA卻可以超過細(xì)菌總DNA的60%。因此，要想獲得大量DNA，選擇直接法較好，當(dāng)所需DNA量不大，而且要排除真核或胞外DNA污染時(shí)，可用間接提取法。

直接提取對某些特定樣品用特定的操作方法能獲得較高的提取效率，但是對有些生物量不高的樣品則很難得到足夠的環(huán)境總DNA用于后續(xù)操作，適合在樣品生物量較大但采樣量不大的情況下采用。間接提取在提取效率上遠(yuǎn)小于直接提取，但用間接提取法所得到的環(huán)境總DNA純度較高，所有樣品能直接用于PCR擴(kuò)增，并且能更好地體現(xiàn)樣品中微生物的多樣性，適用于有大量樣品的情況。

2.3 DNA的純度和濃度測定

DNA在260 nm處有吸收峰，腐殖酸在230 nm處有吸收峰，計(jì)算OD230/OD260（腐殖酸/DNA）的比值可以確定所提DNA中腐殖酸的污染程度。一般情況下OD230/OD260比值應(yīng)在0.4～0.5之間為好， OD230/OD260比值越高，腐殖酸污染越嚴(yán)重。蛋白質(zhì)在280 nm處有吸收峰，因此OD260/OD280比值經(jīng)常被用來指示DNA中蛋白質(zhì)的污染程度，當(dāng)OD260/OD280比值為1.8～2.2時(shí)，DNA較純，當(dāng)受蛋白質(zhì)或其他雜質(zhì)污染時(shí)，OD260/OD280值則較低[41]。此外，還可采用PCR擴(kuò)增檢測DNA的純化質(zhì)量，所用擴(kuò)增引物見文獻(xiàn)[42]。

提取的DNA濃度也可根據(jù)測定的OD260值計(jì)算，根據(jù)公式[dsDNA]=50×OD260×稀釋倍數(shù)，計(jì)算DNA的濃度（μg/mL），換算出每克干土提取DNA的量[43]；還可采用DyNA Quant 200熒光儀對純化后DNA的濃度進(jìn)行測定[28]。

3 影響土壤微生物總DNA提取的因子

土壤成分復(fù)雜，含有大量的有機(jī)及無機(jī)等多種生物活性抑制物，如腐殖酸、多酚類化合物、重金屬等，它們的存在可能影響土壤DNA的提取質(zhì)量，抑制DNA聚合酶的活性從而影響土壤微生物多樣性的分析。研究發(fā)現(xiàn)，腐殖酸是土壤DNA提取過程中極難去除的污染物，由于它的分子大小和理化性質(zhì)與DNA相似，過分注重腐殖酸的去除，勢必會造成DNA的大量損失，因此腐殖酸的有效去除是土壤DNA提取的難點(diǎn)所在。

各種土壤類型、質(zhì)地和成分的差異，都會影響土壤微生物DNA的提取效果。Zhou等[44]用SDS-CTAB法從8種土壤（包括沃土、沙沃土和沙黏土，其中黏土含量為5%～31%不等）中提取DNA，平均獲得DNA的量為0.5～26.9 μg/g，并發(fā)現(xiàn)獲得的DNA量與土壤的有機(jī)磷含量有明顯的正相關(guān)關(guān)系。另外，研究也發(fā)現(xiàn)，土壤中細(xì)菌的裂解效率與其中黏粒的含量呈明顯的負(fù)相關(guān)。土壤中各粒級顆粒對細(xì)菌的吸附量從大到小的順序?yàn)椋吼ち?、粉粒、?xì)沙粒、粗沙粒，其中黏粒是粉粒的3.7～4.9倍、細(xì)沙粒的44.3～89.2倍、粗沙粒的262.0～799.0倍，細(xì)菌在粒徑不同的土壤顆粒表面的最大與最小吸附量分別相差389.0和857.0倍，去有機(jī)質(zhì)土壤顆粒對細(xì)菌吸附親和力較含有機(jī)質(zhì)土壤顆粒的大[45]。因此，不同的土壤適合于不同的DNA提取方法，在土壤DNA提取過程中，應(yīng)針對土壤類別選取合適的提取方法，以便進(jìn)行后續(xù)研究。

4 小結(jié)

從土壤微生物群體基因組的角度研究其多樣性及功能是可行的方法，并受到廣泛的關(guān)注[46]。因而越過分離培養(yǎng)的步驟，直接從土壤中獲得總DNA以分析土壤微生態(tài)群落結(jié)構(gòu)，關(guān)鍵是如何盡可能全面地提取土壤中微生物的總DNA。土壤本身成分復(fù)雜，有許多物質(zhì)難以預(yù)料，對提取較好質(zhì)量的DNA提出了很高的要求。因此建立一種簡單有效的提取方法顯得非常重要。

間接法提取的微生物DNA純度較高，提取的種類和數(shù)量較少；直接提取法直接在土壤中裂解細(xì)胞，使其中內(nèi)含物盡可能地釋放，能夠代表大部分的土壤微生物，但土壤中所含物質(zhì)種類較復(fù)雜，所以提取的DNA質(zhì)量受到很大的影響，需要進(jìn)一步純化，而這些處理往往造成部分DNA的喪失，可能使在土壤中本身存在量較少的種類喪失或檢測不到，影響到土壤微生物多樣性的分析。最近，Milko等[47]發(fā)現(xiàn)一種Taq DNA聚合酶基因突變型可增加對腐殖酸等PCR抑制物的抗性，不需要對基因組DNA進(jìn)行純化就可以進(jìn)行后續(xù)的分子生物學(xué)分析，因此具有廣泛的應(yīng)用前景。

絕大多數(shù)直接提取法提取的DN段長度不會超過23 kb，而DNA的某些用途如宏基因組文庫構(gòu)建，需要大片段的DNA，直接提取法對此幾乎無能為力。

在DNA提取產(chǎn)率高即表示其所代表的微生物多樣性高的前提下，DNA直接提取法被認(rèn)為是較好的方法并被廣泛應(yīng)用[48]。但近年來有研究表明DNA提取的產(chǎn)率高不等同于微生物的多樣性高，間接提取法又再次被提出并用于相關(guān)研究[49]。這就要求在選擇提取方法時(shí)不僅要試用直接提取和間接提取這兩類方法，而且在每類方法中也要試用不同的處理組合方式，以使后續(xù)操作能順利進(jìn)行，并得到準(zhǔn)確可信的研究結(jié)果。

評價(jià)一種土壤微生物DNA提取方法是否有效，除了通常要求的提取片段無降解且比較完整外，還需要能夠有效去除土壤中大量存在的影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的物質(zhì)，如腐殖酸、腐殖酸似物、酚類化合物、重金屬離子等；能在單位樣本量中比較徹底地提取出微生物DNA；提取方法應(yīng)具有普適性，對土壤中大多數(shù)微生物能夠有效等[50]，且提取的DNA能更好地代表土壤微生物的真實(shí)性和異質(zhì)性。

5 展望

目前，國內(nèi)外對土壤微生物總DNA提取方法的報(bào)道很多，但每一種方法都存在一定的缺陷。因此，從土壤樣品中提取DNA還沒有通用的最佳方案，需要根據(jù)具體的土壤特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)室條件和實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。在提取過程中還要兼顧實(shí)驗(yàn)操作是否簡便，方法是否經(jīng)濟(jì)以及樣品量是否充足。另外，將現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)微生物研究方法結(jié)合起來，才能更全面地認(rèn)識和理解土壤微生物群落多樣性及其相應(yīng)的生態(tài)功能。

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微生物多樣性分析范文第3篇

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43.小興安嶺7種典型林型林分生物量碳密度與固碳能力 

44.東北林區(qū)4個(gè)天然針葉樹種單木生物量模型誤差結(jié)構(gòu)及可加性模型

45.指數(shù)施肥對楸樹無性系生物量分配和根系形態(tài)的影響

46.牛糞生物炭對水中氨氮的吸附特性  

47.黃土丘陵區(qū)生物結(jié)皮對土壤物理屬性的影響 

48.半干旱沙地生境變化對植物地上生物量及其碳、氮儲量的影響

49.青藏高原東緣野生暗紫貝母生物量分配格局對高山生態(tài)環(huán)境的適應(yīng) 

50.長江口及東海春季底棲硅藻、原生動物和小型底棲生物的生態(tài)特點(diǎn)  

51.全球生物多樣性評估方法及研究進(jìn)展  

52.中國生物多樣性就地保護(hù)的研究與實(shí)踐 

53.溫度與降水協(xié)同作用對短花針茅生物量及其分配的影響 

54.環(huán)境質(zhì)量評價(jià)中的生物指示與生物監(jiān)測  

55.土壤生物多樣性研究:歷史、現(xiàn)狀與挑戰(zhàn) 

56.轉(zhuǎn)錄因子對木質(zhì)素生物合成調(diào)控的研究進(jìn)展 

57.太赫茲科學(xué)技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用研究 

58.玉米秸稈生物炭對Cd2+的吸附特性及影響因素  

59.中國糧食作物秸稈焚燒排碳量及轉(zhuǎn)化生物炭固碳量的估算

60.生物炭對我國南方紅壤和黃棕壤理化性質(zhì)的影響  

61.黑龍江省大興安嶺森林生物量空間格局及其影響因素 

62.不同生物質(zhì)原料水熱生物炭特性的研究 

63.鳳眼蓮、稻草和污泥制備生物炭的特性表征與環(huán)境影響解析 

64.東北地區(qū)兩個(gè)主要樹種地上生物量通用方程構(gòu)建 

65.不同來源生物炭對砷在土壤中吸附與解吸的影響 

66.生物炭生產(chǎn)與農(nóng)用的意義及國內(nèi)外動態(tài) 

67.秸稈生物反應(yīng)堆與菌肥對溫室番茄土壤微環(huán)境的影響 

68.生物炭對土壤肥料的作用及未來研究 

69.玉米秸稈生物炭對土壤無機(jī)氮素淋失風(fēng)險(xiǎn)的影響研究

70.黃土丘陵區(qū)生物結(jié)皮對土壤可蝕性的影響 

71.內(nèi)蒙古草甸草原與典型草原地下生物量與生產(chǎn)力季節(jié)動態(tài)及其碳庫潛力

72.生物炭添加對黃土高原典型土壤田間持水量的影響

73.生物炭對黃土區(qū)土壤水分入滲、蒸發(fā)及硝態(tài)氮淋溶的影響

74.生物炭及其復(fù)合材料的制備與應(yīng)用研究進(jìn)展 

75.生物炭及炭基硝酸銨肥料對土壤化學(xué)性質(zhì)及作物產(chǎn)量的影響 

76.臭冷杉生物量分配格局及異速生長模型

77.施用生物炭后塿土土壤微生物及酶活性變化特征 

78.寧夏荒漠草原不同群落生物多樣性與生物量關(guān)系及影響因子分析

79.中國生物多樣性調(diào)查與保護(hù)研究進(jìn)展 

80.三種小球藻生物柴油品質(zhì)指標(biāo)評價(jià) 

81.AM真菌對重金屬污染土壤生物修復(fù)的應(yīng)用與機(jī)理 

82.含度量誤差的黑龍江省主要樹種生物量相容性模型

83.生物炭與農(nóng)業(yè)環(huán)境研究回顧與展望 

84.氮磷添加對巨桉幼苗生物量分配和C:N:P化學(xué)計(jì)量特征的影響  

85.生物炭對土壤肥力與環(huán)境質(zhì)量的影響機(jī)制與風(fēng)險(xiǎn)解析 

86.東北林區(qū)天然白樺相容性生物量模型  

87.氮肥與生物炭施用對稻麥輪作系統(tǒng)甲烷和氧化亞氮排放的影響

88.黃土高原丘陵區(qū)生物結(jié)皮土壤的斥水性

89.檢測食品沙門氏菌的生物傳感器持久性研究  

90.生物炭對砂壤土節(jié)水保肥及番茄產(chǎn)量的影響研究

91.土壤碳收支對秸稈與秸稈生物炭還田的響應(yīng)及其機(jī)制

92.抑制煙草青枯病型生物有機(jī)肥的田間防效研究 

93.生物炭對塿土土壤含水量、有機(jī)碳及速效養(yǎng)分含量的影響

94.生物炭對寧夏引黃灌區(qū)水稻產(chǎn)量及氮素利用率的影響 

95.茶葉生物化學(xué)研究進(jìn)展

96.鄂爾多斯盆地西緣奧陶紀(jì)生物礁基本特征、分布規(guī)律及成礁模式

97.中國履行《生物多樣性公約》二十年:行動、進(jìn)展與展望 

98.不同時(shí)期施用生物炭對稻田N_2O和CH_4排放的影響

99.生物炭對設(shè)施連作黃瓜根域基質(zhì)酶活性和微生物的調(diào)節(jié)

100.生物有機(jī)肥對連作蕉園香蕉生產(chǎn)和土壤可培養(yǎng)微生物區(qū)系的影響  

101.柴達(dá)木盆地幾種荒漠灌叢植被的生物量分配格局 

102.牛糞生物炭對磷的吸附特性及其影響因素研究

103.紅樹林植物生物量研究進(jìn)展

104.農(nóng)業(yè)活動及轉(zhuǎn)基因作物對農(nóng)田生物多樣性的影響

105.煤矸石場植被自然恢復(fù)初期草本植物生物量研究

106.鐵改性生物炭對磷的吸附及磷形態(tài)的變化特征 

107.青藏高原草地地下生物量與環(huán)境因子的關(guān)系 

108.蔬菜種植農(nóng)戶施用生物農(nóng)藥意愿研究

109 生物炭對夏玉米生長和產(chǎn)量的影響

110.不同生物炭添加量下植煙土壤養(yǎng)分的淋失

111.生物DNA條形碼:十年發(fā)展歷程、研究尺度和功能

112.生物炭和生物炭基氮肥的理化特征及其作物肥效評價(jià)

113.木質(zhì)素與生物燃料生產(chǎn):降低含量或解除束縛?

114.生物炭添加對半干旱地區(qū)土壤溫室氣體排放的影響

115.磷回收對厭氧/好氧交替式生物濾池蓄磷/除磷的影響 

116.天山林區(qū)六種灌木生物量的建模及其器官分配的適應(yīng)性

117.非模式生物轉(zhuǎn)錄組研究

118.添加生物炭對灌淤土土壤養(yǎng)分含量和氮素淋失的影響 

119.生物炭和腐植酸類對豬糞堆肥重金屬的鈍化效果 

120.間伐對川西亞高山粗枝云杉人工林細(xì)根生物量及碳儲量的影響

121.生物多樣性信息學(xué)研究進(jìn)展 

122.長白落葉松林齡序列上的生物量及碳儲量分配規(guī)律 

123.不同燒制溫度下玉米秸稈生物炭的性質(zhì)及對萘的吸附性能

124.利用農(nóng)業(yè)生物多樣性持續(xù)控制有害生物 

125.騰格里沙漠東南緣4種灌木的生物量預(yù)測模型

126.生物炭碳封存技術(shù)研究進(jìn)展 

127.豬糞制備的生物炭對西維因的吸附與催化水解作用 

128.生物炭修復(fù)土壤重金屬污染的研究進(jìn)展

129.古爾班通古特沙漠4種荒漠草本植物不同生長期的生物量分配與葉片化學(xué)計(jì)量特征

130.生物炭覆蓋對底泥污染物釋放的影響

131.閩楠幼樹光合特性及生物量分配對光環(huán)境的響應(yīng)

微生物多樣性分析范文第4篇

關(guān)鍵詞 生物入侵；馬纓丹；根際土壤；土壤理化性質(zhì)

中圖分類號 S451 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）20-0084-03

Effects of Lantana camara Invasion on Soil Physical-chemical Properties in Rhizosphere and Non-rhizosphere Zone

KANG Xiao-wu DAI Ting-ting

（Institute of Tropical and Subtropical Ecology，South China Agricultural University，Guangzhou Guangdong 510642）

Abstract The effects of L.camara invasion on rhizosphere and non-rhizosphere soil nutrients，soil enzyme activities，microbial biomass with microbial functional diversity were studied by quadrat experiment in the field.The experimental results showed that the invasion of L.camara significantly improved the content of soil organic matter，total nitrogen，total potassium，nitrogen，available phosphorus，potassium and microbial biomass carbon，nitrogen，phosphorus.At the same time，the invasion significantly improved the activity of soil urease，protease，sucrosemetabolic，cellulase，catalase and the metabolic activity，carbon source utilization and diversity index of soil microbial community.The promoting effect was higher on the rhizospheric soil than on the non-rhizospheric soil （bulk soil）.

Key words bioinvasion；Lantana camara；rhizosphere soil ；soil physical-chemical properties

馬纓丹（Lantana camara）為馬鞭草科（Verbenaceae）馬纓丹屬（Lantana）多年生常綠灌木，原產(chǎn)于熱帶美洲，現(xiàn)廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，是世界上危害最嚴(yán)重的100種有害外來入侵物種之一[1]。馬纓丹作為一種外來入侵植物，植株繁殖能力強(qiáng)，蔓延迅速，能夠在短時(shí)間內(nèi)大面積侵占森林、果園、牧場和農(nóng)耕地，破壞當(dāng)?shù)氐纳锒鄻有院妥匀簧鷳B(tài)系統(tǒng)，并因其植株有毒而嚴(yán)重威脅到人畜健康和農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)[2-3]。1645 年馬纓丹作為一種觀賞花卉引入我國，現(xiàn)已在廣東、廣西、海南、云南等地大量蔓延擴(kuò)散，對當(dāng)?shù)氐纳锒鄻有?、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)安全造成嚴(yán)重威脅[4-5]。

有研究表明，一年蓬（Erigeron annual Fleabane）、加拿大蓬（Erigeron canadensis）、加拿大一枝黃花（Solidago canad-ensis）等植物入侵后對根際土壤理化性質(zhì)產(chǎn)生了不同程度的影響[5-6]；外來入侵植物紫莖澤蘭（Eupatorium adenopho-rum）、黃頂菊（Flaveria bidentis）等可以不同程度地提高入侵地土壤的全磷養(yǎng)分和速效養(yǎng)分[7-8]。目前，國內(nèi)外學(xué)者在馬纓丹的生物學(xué)特性、分布危害、防治以及開發(fā)利用等方面開展了大量的工作，但對馬纓丹植株的化感作用及其入侵對土壤微生態(tài)特性的影響研究較少[9-15]。筆者通過野外樣方試驗(yàn)，研究了馬纓丹入侵對根際、非根際的土壤養(yǎng)分、土壤酶活性、土壤微生物生物量與土壤微生物功能多樣性的影響效應(yīng)，旨在從化感作用、土壤反饋?zhàn)饔玫慕嵌忍剿黢R纓丹的入侵機(jī)制及入侵效應(yīng)，從而為更好地管理、控制馬纓丹的入侵危害提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

馬纓丹單優(yōu)群落的根際土壤與非根際土壤均采自于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)增城教學(xué)基地。

1.2 試驗(yàn)方法

在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)增城教學(xué)科研基地，選取馬纓丹單優(yōu)群落（馬纓丹植株覆蓋率80%～90%，群落高度150～250 cm，入侵年限大于6年）內(nèi)的健壯植株，用鋤頭挖取植株地下根系（0～20 cm），抖去根系上的大塊土壤，然后用細(xì)毛刷刷取根系表層黏貼的土壤，去除雜質(zhì)后作為根際土壤，而拌落后的大塊土壤作為非根際土壤；同時(shí)選取距離馬纓丹群落50 m以外，且周圍都沒有馬纓丹植株生長的荒坡草地的表層土壤（0～10 cm）作為對照（CK）。每個(gè)處理3次重復(fù)，每次重復(fù)之間相隔200 m以上。將采集的土壤裝袋運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，其中一部分土樣置于室內(nèi)自然風(fēng)干，除去動植物殘?bào)w，研磨過100目篩，用于土壤養(yǎng)分含量、土壤酶活性的測定分析；另一部分樣品暫時(shí)冷藏于-18 ℃冰箱，用于測定土壤微生物生物量碳、氮、磷。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均在Microsoft Excel上完成處理，通過SPSS 13.0進(jìn)行方差分析（one way ANOVA），并采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬纓丹入侵對根際、非根際土壤全量、速效養(yǎng)分的影響

2.1.1 土壤全量養(yǎng)分。土壤有機(jī)質(zhì)、全氮（TN）和全鉀（TK）含量在各處理中的變化規(guī)律一致，即根際土壤的含量最高，非根際土壤次之，CK的含量最小，各處理的差異顯著（表1）。其中與 CK相比，根際土壤的有機(jī)質(zhì)、TN和TK含量分別增加40.77%、38.13%、30.16%；而與非根際土壤相比，則分別增加23.24%、14.97%和13.11%。對于土壤TP含量，根際土壤分別比CK、非根際土壤增加65.22%、58.33%，差異顯著；而非根際土壤的TP含量雖略高于CK，但差異不顯著。說明馬纓丹入侵能顯著提高自身根際的土壤有機(jī)質(zhì)、TN、TP和TK含量，同時(shí)也顯著提高非根際的土壤有機(jī)質(zhì)、TN和TK的含量，但相對而言，其對根際土壤養(yǎng)分的提升效果更加明顯。

2.1.2 土壤速效養(yǎng)分。在3個(gè)處理中，馬纓丹根際土壤的堿解氮含量最高，并且顯著高于非根際土壤和CK，而非根際土壤的堿解氮含量雖然略高于CK，但兩者的差異不顯著（表2）。對于土壤的速效磷、速效鉀含量，均表現(xiàn)為根際土壤的含量最高，非根際土壤的含量次之，CK的含量最低，各處理間的差異顯著。其中與CK相比，根際、非根際土壤的堿解氮含量分別增加32.67%和0.75%，速效磷含量分別增加87.14%和48.87%，速效鉀含量分別增加115.70%和62.72%，可見馬纓丹入侵能顯著提高土壤堿解氮、速效磷和速效鉀含量，尤其是對根際土壤的養(yǎng)分提升作用更強(qiáng)。

2.2 馬纓丹入侵對根際、非根際土壤酶活性的影響

與CK相比，馬纓丹入侵顯著提高了土壤脲酶、蛋白酶活性，其中根際土壤的脲酶、蛋白酶活性分別比CK提高104.06%和74.34%，非根際土壤的脲酶、蛋白酶活性也分別比CK增加45.53%和46.90%?？梢?，馬纓丹入侵對根際土壤脲酶、蛋白酶活性的促進(jìn)效果更強(qiáng)。土壤蔗糖酶、纖維素酶的活性變化也呈現(xiàn)類似的規(guī)律，即在3個(gè)處理中均表現(xiàn)為根際、非根際土壤的酶活性顯著高于CK，且根際土壤的酶活性亦顯著高于非根際土壤（表3）。其中根際、非根際土壤的蔗糖酶活性分別是CK的227.56%和157.11%，纖維素酶活性分別是CK的264.39%和161.73%?？梢姡R纓丹入侵能顯著提高根際、非根際土壤中蔗糖酶和纖維素酶的活性，加強(qiáng)對土壤中有機(jī)碳的利用，并且這種增強(qiáng)效應(yīng)在根際土壤的表現(xiàn)更為顯著。另外，馬纓丹入侵亦能顯著提高自身根際、非根際土壤的過氧化氫酶活性，與CK相比，其增幅分別達(dá)到45.95%和27.03%

2.3 馬纓丹入侵對根際、非根際土壤微生物生物量的影響

土壤微生物生物量碳、氮、磷含量在各個(gè)處理中的變化規(guī)律一致，均表現(xiàn)為根際、非根際土壤含量顯著高于CK，同時(shí)根際土壤含量亦顯著高于非根際土壤（表4）。其中與CK相比，根際土壤微生物生物量碳、氮、磷的含量分別提高238.76%、53.55%、243.61%，非根際土壤微生物生物量碳、氮、磷含量也分別提高130.31%、14.34%、124.15%?？梢姡R纓丹入侵對根際土壤微生物生物量碳、氮、磷含量的提升效應(yīng)更強(qiáng)。

2.4 馬纓丹入侵對根際、非根際土壤微生物群落功能多樣性的影響

2.4.1 土壤微生物群落代謝活性。平均孔顏色變化率（average well color development，AWCD）反映土壤微生物利用碳源的整體能力與代謝活性，也是評價(jià)利用單一碳源能力的重要指標(biāo)，可作為微生物整體活性的有效指標(biāo)。AWCD 值的變化（斜率）和最終能達(dá)到的值反映了土壤微生物利用某一碳源物質(zhì)的能力。由圖1可知，各處理中土壤微生物的AWCD值均隨著培育時(shí)間的延長不斷上升，變化趨勢一致。在最初的24 h內(nèi)AWCD變化較小，24～72 h急劇上升，然后持續(xù)緩慢升高。培養(yǎng)期間CK土壤微生物群落的AWCD值均處于較低水平，根際土壤微生物群落的AWCD值則處于最高水平，各處理的AWCD在整個(gè)培育周期內(nèi)均表現(xiàn)為根際土壤>非根際土壤>CK，其中根際土壤在培養(yǎng)24 h后一直到培養(yǎng)結(jié)束，其微生物群落的AWCD值均顯著高于CK，亦顯著高于非根際土壤；而非根際土壤在0～72 h內(nèi)的AWCD值與CK差異不顯著，72 h后與CK差異顯著。這說明馬纓

丹入侵后明顯提高了土壤微生物群落的代謝活性，并且對根際土壤的影響效應(yīng)更明顯。

2.4.2 土壤微生物群落碳源利用率。在6類碳源中，馬纓丹非根際土壤微生物群落對氨基類、酚類碳源的利用率與CK的差異不顯著，但對其他碳源的利用率則顯著高于CK（表5）。而根際土壤微生物群落對6類碳源的利用率均顯著高于CK，亦顯著高于非根際土壤，其中根際土壤微生物群落對碳水化合物類、羧酸類、聚合物類、氨基酸類、酚類和胺類碳源的利用率分別比CK增加96.91%、83.70%、82.43%、41.13%、55.74%和110.45%。可見，馬纓丹入侵顯著提高了土壤微生物群落對6種碳源的利用率，尤其對根際土壤的改善作用更強(qiáng)。

2.4.3 土壤微生物群落碳源利用的多樣性。與CK相比，馬纓丹入侵顯著提高了根際土壤微生物群落的Shannon-Wiener指數(shù)H′、Mc Intosh指數(shù)U、豐富度指數(shù)S和Simpson優(yōu)勢度指數(shù)Ds，而非根際土壤微生物群落的Mc Intosh指數(shù)U、豐富度指數(shù)S也顯著上升。對于Pielou均勻度指數(shù)E，各處理的差異均不明顯。說明馬纓丹入侵能夠促進(jìn)土壤微生物群落功能多樣性的提高，尤其對根際土壤的影響更強(qiáng)。

3 結(jié)論與討論

植物對土壤養(yǎng)分的吸收利用與土壤對植物生長發(fā)育過程中的反饋?zhàn)饔檬俏锓N競爭取勝的重要驅(qū)動機(jī)制之一[16]。大多數(shù)研究指出，外來植物入侵能夠加快土壤營養(yǎng)循環(huán)過程，提高土壤肥力，有利于促進(jìn)自身的進(jìn)一步入侵?jǐn)U散。外來植物皺果莧入侵后，土壤中碳、氮、磷的濃度顯著上升，其中入侵區(qū)的全磷、可溶性磷幾乎分別提高3倍和2倍[17]。土壤酶主要來源于土壤微生物的代謝過程和土壤中植物、動物的活體分泌或殘?bào)w分解，能夠參與土壤生態(tài)系統(tǒng)許多重要的生物化學(xué)過程和物質(zhì)循環(huán)，通過催化土壤中的生化反應(yīng)發(fā)揮重要作用，能夠客觀地反映土壤肥力狀況與系統(tǒng)功能[18-21]。土壤微生物生物量是土壤中最活躍的肥力因子之一，參與土壤有機(jī)質(zhì)分解、腐殖質(zhì)形成和土壤養(yǎng)分的循環(huán)轉(zhuǎn)化過程，能夠反映土壤同化與礦化能力的高低，是土壤生態(tài)系統(tǒng)肥力的重要生物學(xué)指標(biāo)[22]。在外來植物與本地植物的關(guān)系中，土壤微生物群落可能起到了橋梁作用，外來植物通過改變土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)組成、區(qū)系數(shù)量與生理功能，破壞土著植物與土壤微生物在長期演化過程所形成的平衡共生關(guān)系，影響土著種的資源獲取、生長繁殖與種群更新，從而使自身在競爭中獲得更大優(yōu)勢，成功入侵[23-25]。

本研究結(jié)果表明，馬纓丹入侵后，根際、非根際土壤的有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷和全鉀均顯著上升，并且馬纓丹入侵對根際土壤養(yǎng)分的提升效果更為顯著，根際土壤的有機(jī)質(zhì)、全氮、全鉀含量均顯著高于非根際土壤。同時(shí)，馬纓丹入侵亦能顯著提高土壤的速效養(yǎng)分，馬纓丹根際、非根際土壤中的堿解氮、速效磷和速效鉀均顯著高于對照；并且馬纓丹根際土壤的速效養(yǎng)分亦顯著高于非根際土壤?？梢?，馬纓丹入侵顯著提高了土壤不同肥力特征，且對根際土壤肥力的提高作用更強(qiáng)，而根際土壤的養(yǎng)分更有利于根系的吸收利用，這可能是馬纓丹能夠入侵成功和快速擴(kuò)張蔓延的生態(tài)機(jī)制之一。馬纓丹的入侵顯著提高了土壤脲酶、蛋白酶、蔗糖酶、纖維素酶和過氧化氫酶的活性，且根際土壤酶的活性均顯著高于非根際土壤。這說明馬纓丹的入侵有利于土壤營養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)轉(zhuǎn)化過程。入侵區(qū)土壤酶活性較高，這將有利于活化土壤養(yǎng)分，提高其有效性，進(jìn)而促進(jìn)自身的入侵蔓延。馬纓丹入侵能夠顯著提高土壤微生物生物量碳、氮、磷的含量，且根際土壤的微生物生物量碳、氮、磷含量顯著高于非根際土壤。馬纓丹入侵后能顯著提高土壤微生物群落的代謝活性、碳源利用率和多樣性指數(shù)，并且其對根際土壤的影響效應(yīng)顯著高于非根際土壤。說明馬纓丹入侵后能通過提高自身生境土壤的微生物群落代謝活性從而促進(jìn)土壤養(yǎng)分循環(huán)與轉(zhuǎn)化，這也許是馬纓丹成功入侵?jǐn)U散的原因之一。本文僅研究探討了馬纓丹入侵對土壤養(yǎng)分、土壤微生物生物量、土壤微生物功能多樣性的影響效應(yīng)，而關(guān)于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化及其反饋?zhàn)饔茫蛇M(jìn)一步闡明馬纓丹成功入侵以及對本地植物生長影響的土壤生態(tài)學(xué)機(jī)理，今后可加強(qiáng)該方面的研究。

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微生物多樣性分析范文第5篇

1氧化亞鐵硫桿菌的生理特性

氧化亞鐵硫桿菌(Thiobacillus ferrooxidans):是生物濕法冶金過程主要的浸礦菌種。這種菌系短桿菌,很小,0.3～0.5×1.0-2.0um,圓鈍末端,以單個(gè)、雙個(gè)或幾個(gè)成短鏈狀存在。是一種化能自養(yǎng)菌,專性好氧,嗜酸性,廣泛生活在金屬硫化礦和煤礦的酸性礦坑水中。最適生長溫度25℃～30℃。生長在pH1.4～6.0之間,最適pH2.0～2.5。T.f以氧化亞鐵、元素硫以及還原態(tài)的硫化合物等來獲得生命過程所需的能量,以空氣中的二氧化碳為碳源,以氨或銨鹽為氮源。有鞭毛,能快速游動,革蘭氏染色陰性。在9K固體培養(yǎng)基上呈紅棕色菌落,近桿形[5]。

2氧化亞鐵硫桿菌的氧化機(jī)理

自20世紀(jì)60年代以來,因?yàn)樗鼈兙哂刑厥獾纳飳W(xué)功能,吸引了許多學(xué)者對T.f和T.t的生理特性進(jìn)行了研究。許多研究表明,T.t利用單質(zhì)硫的能力比T.f強(qiáng),但T.t不能利用硫酸亞鐵。Wong和Henry對氧化硫酸亞鐵的機(jī)理進(jìn)行了詳細(xì)的研究,指出能將亞鐵氧化成三價(jià)鐵,三價(jià)鐵會與硫酸根離子發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生鐵礬沉淀,同時(shí)產(chǎn)生硫酸而引起pH的下降:

4FeSO4+02+2H2SO42Fe2(SO4)3+2H2O

(1)

6Fe3++4SO42-+12H2O2HFe3(SO4)2(OH)6 +10H+(2)

Templellvl和Leathen等人研究發(fā)現(xiàn)氧化亞鐵硫桿菌能將礦物中的硫化礦物氧化為硫酸和硫酸鹽。Bryne等對T.f氧化硫化礦物的機(jī)制進(jìn)行了詳細(xì)的研究。并提出了一些常見礦物的主要反應(yīng)機(jī)理,如黃鐵礦和黃銅礦:

2FeS2+702+2H202FeSO4+2H2SO4

(3)

4FeSO4+02+2H2SO42Fe2(SO4)3+2H20

(4)

CuFeS2+402CuS04+FeSO4 (5)

2Cu2S+02+2H2 SO42CuS+2CuSO4+2H20

(6)

CuS+202CuS04(7)

3微生物分子生態(tài)學(xué)研究的一般方法和原理

微生物分子生態(tài)學(xué)是分子生態(tài)學(xué)的重要組成部分,是分子生物學(xué)、微生物生態(tài)學(xué)、微生物生理學(xué)與遺傳學(xué)相互結(jié)合而產(chǎn)生的一門邊緣學(xué)科。從目前的發(fā)展?fàn)顩r來看,當(dāng)前的主要研究領(lǐng)域有:采用分子生物學(xué)技術(shù)研究不同自然環(huán)境中微生物的種類組成和群落結(jié)構(gòu)以及它們的數(shù)量動態(tài)；環(huán)境因子對微生物基因表達(dá)的影響:自然條件下微生物之間遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移:微生物與高等生物相互作用的分子機(jī)制,包括共生關(guān)系的建立、病原微生物的致病機(jī)制等。因此,微生物分子生態(tài)學(xué)是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)的基礎(chǔ)理論與技術(shù),在分子水平上,研究微生物與其生態(tài)環(huán)境間相互關(guān)系的一門新興學(xué)科。

3.1 一般研究方法

(1)平板涂布分離。

(2)顯微鏡觀察:普通光鏡、相差顯微鏡、透射電鏡、掃描電鏡。

(3)MPN法,即最大或然值計(jì)數(shù)法,是平板涂布分離法的一種,但由于廣泛應(yīng)用,被單獨(dú)作為微生物研究的一種技術(shù)。

(4)活菌計(jì)數(shù)法,常見的用啞嚨橙染色,活菌死菌顏色不一樣。

3.2 分子研究方法

(1)純種分離,G+C測定、16SrDNA, ISR測序、比對。

(2)變性梯度凝膠電泳(DGGE),通用引物PCR擴(kuò)增同樣長度的基因,常為16S的一段(300bp～400bp),割膠純化、克隆測序,比對變性梯度凝膠電泳((DGGE)技術(shù)以土壤微生物群體的基因組DNA為研究對象,通過比較不同土壤中各種微生物的16SrRNA基因信息來了解微生物的多樣性。

(3)FISH熒光原位雜交,設(shè)計(jì)不同熒光染料標(biāo)記的特異探針,檢測不同分類界元水平的細(xì)菌,可在細(xì)胞水平或者核酸水平與目標(biāo)菌種雜交,在表面熒光顯微鏡或者CLSM(共聚焦激光掃描顯微鏡)下監(jiān)測。

(4)TRFLP,末端限制性長度多態(tài)性。

(5)ARDREA.RISA。

(6)流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)。

(7)Real-time實(shí)時(shí)熒光定量PCR監(jiān)測技術(shù)。

(8)克隆轉(zhuǎn)化法:通用引物擴(kuò)增從水樣、土樣中提取得總DNA,獲得全長的16S rDNA序列,隨機(jī)克隆入載體,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌,挑取陽性菌落,用不同的限制酶酶切檢測不同的克隆,測序、比對。

(9)DNA芯片技術(shù),主要用來研究微生物的功能基因組學(xué)。

4本論文的立論依據(jù)

AMD的pH通常很低,嚴(yán)重的地方可達(dá)pH2.0,富含SO42-離子和Fe3+離子,易浸出廢礦石中的有毒元素,如鉛、砷、鉻、銅等以及氰化物,對礦業(yè)生產(chǎn)、生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重危害,所以就AMD的研究越來越重要。我國自1959年以來,對微生物處理污水的技術(shù)的研究已取得了一定的成果,但重點(diǎn)放在污水菌種的保藏的研究方面,而且就整體情況而言與國外相比要差的遠(yuǎn),在污水處理微生物生物學(xué)方面的研究相對于前者明顯滯后。不僅設(shè)備、工藝落后,更主要的是對微生物本身沒有作進(jìn)一步的研究,缺乏對菌種生物學(xué)性狀較為全面的認(rèn)識,譬如菌種的生理、生化性狀以及分類地位的了解,缺乏對菌種分子水平上的認(rèn)識及其在污水處理過程中菌種所參與的機(jī)理等的研究,因而也就不能很好的指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐。從目前發(fā)表的一些較為零碎的文獻(xiàn)及幾本專著看出,在酸性污水中細(xì)菌的研究方面,生物領(lǐng)域的科技工作非常薄弱,主要是一些污水治理方面的專業(yè)人員在從事相關(guān)研究。

目前,我國對浸礦細(xì)菌的資源開發(fā)工作做的遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠,根據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道,用于處理酸性污水的細(xì)菌有氧化硫硫桿菌(A.Thiooxidans)和氧化亞鐵硫桿菌((Acidithiobacillus ferrooxidans);鉤端螺菌(Leptospirillum)、中等嗜高溫菌,如文獻(xiàn)報(bào)道的硫化桿菌屬(Sulfobacillus),如熱氧化硫化桿菌(Sulfobacillus thermosuidooxidan)以及一些未確定分類位置的細(xì)菌、嗜酸嗜高溫古細(xì)菌等。就細(xì)菌遺傳多樣性、系統(tǒng)學(xué)研究工作來說,目前國內(nèi)發(fā)表的文獻(xiàn)主要集中在放線菌、根瘤菌、嗜鹽堿的古菌方面,對硫桿菌其他浸礦細(xì)菌的多樣性及系統(tǒng)發(fā)育工作而言,國內(nèi)尚見較為系統(tǒng)的報(bào)道。因此,對硫桿菌及其它浸礦細(xì)菌的多樣性研究就很有必要。

(1)硫桿菌(Thiobacillus)及其它嗜酸菌分子系統(tǒng)學(xué)研究目標(biāo)及意義。

在地球表面廣泛分布有元素硫及其金屬化合物而形成的許多特殊環(huán)境,如硫鐵礦、地表及海底的含硫熱泉等。近年來,由于各國微生物學(xué)家對極端環(huán)境條件中的微生物資源的研究開發(fā)成為一個(gè)熱點(diǎn),使得硫鐵礦、含硫熱泉等酸性條件中的微生物多樣性的研究取得了較快的進(jìn)展,發(fā)現(xiàn)了許多生理生化性狀特殊的細(xì)菌,其中有些歸屬于硫桿菌,有些目前還未確定其系統(tǒng)位置。分子生物學(xué)技術(shù)在含硫的酸性環(huán)境微生物系統(tǒng)學(xué)、生態(tài)學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用,不僅發(fā)現(xiàn)了許多常規(guī)技術(shù)不能發(fā)現(xiàn)的新細(xì)菌,也對這些細(xì)菌的分類及系統(tǒng)學(xué)地位的確定提供了有力的手段,同時(shí)對一些已知細(xì)菌的分類及系統(tǒng)位置進(jìn)行了修訂,使得傳統(tǒng)意義上的硫桿菌分類更趨合理,盡量可以建立一個(gè)亞利士多德所謂的接近于自然的分類體系。對氧化亞鐵硫桿菌系統(tǒng)學(xué)地位的確定不僅具有重要的理論意義,對指導(dǎo)細(xì)菌浸礦等生產(chǎn)實(shí)踐中優(yōu)良菌株的選擇也具有直接的應(yīng)用價(jià)值。我國地域廣闊,各種含硫的礦產(chǎn)資源及自然生態(tài)環(huán)境非常多樣化,蘊(yùn)含著非常豐富的代謝硫的細(xì)菌資源,而倍受國外微生物學(xué)家的關(guān)注,因此加大這些細(xì)菌資源的開發(fā)和研究力度,將為這些細(xì)菌的生產(chǎn)應(yīng)用實(shí)踐奠定理論基礎(chǔ)。本課題研究的目標(biāo)之一就是大量開發(fā)我國不同酸礦環(huán)境中的微生物資源,尤其是一些硫氧化細(xì)菌及其這些細(xì)菌的分子系統(tǒng)學(xué)的研究。

(2)不同環(huán)境中嗜酸菌的遺傳多樣性研究及其意義。

由于Acidithiobacillusferrooxidans,A.thiooxidans,A.caldus, Leptospirillumferroo xidans這幾種細(xì)菌能夠氧化亞鐵、還原性的金屬硫化礦,目前被廣泛應(yīng)用于微生物濕法冶金、煤和天然氣脫硫、酸性礦區(qū)的生態(tài)恢復(fù)治理、污水處理等技術(shù),使得這些細(xì)菌成為微生物學(xué)家研究的熱點(diǎn)之一。但是由于硫礦的化學(xué)組成不同與含硫酸性環(huán)境在地球上的生態(tài)分布與多樣性極其復(fù)雜,使得這類細(xì)菌同一種不同菌株的生理生化性狀表現(xiàn)出顯著的不同,形成了表型差異明顯不同的菌株,同時(shí)造成這些細(xì)菌不同菌株的遺傳組成差異顯著,即所謂的遺傳多樣性,利用分子生物學(xué)技術(shù)研究這些細(xì)菌的遺傳差異,不僅有助于篩選、鑒定出性狀明顯不同、在浸礦實(shí)踐中針對不同化學(xué)組成的礦體表現(xiàn)高效的菌株,反過來也可以從物種進(jìn)化上闡明不同環(huán)境造成的選擇壓對細(xì)菌進(jìn)化的作用以及細(xì)菌對環(huán)境的適應(yīng)性,進(jìn)一步對表型差異懸殊、介于相似種之間的菌株的系統(tǒng)學(xué)地位重新進(jìn)行研究修訂,并且有助于闡明自然界廣泛分布的許多代謝硫、鐵有關(guān)的細(xì)菌的起源及進(jìn)化關(guān)系。目前,雖然微生物冶金基礎(chǔ)研究被列為國家973重點(diǎn)基礎(chǔ)發(fā)展計(jì)劃,但我國在浸礦細(xì)菌的生物學(xué)基礎(chǔ)研究方面所作的工作幾為空白,對這些細(xì)菌的多樣性有待進(jìn)一步研究挖掘。從世界各地大量采集分離純化菌株,進(jìn)一步闡明這些細(xì)菌的分子系統(tǒng)學(xué)及進(jìn)化關(guān)系,從遺傳多樣性的角度選擇優(yōu)良菌株,為應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐提供理論基礎(chǔ)。

由于我國生態(tài)環(huán)境多樣性非常豐富,存在各種各樣的富含金屬及硫化合物的生態(tài)環(huán)境,因此有可能分離到生理及遺傳差異明顯的不同菌種,存在非常豐富的種以上水平和種下水平的多樣性。但到目前為止,國內(nèi)對嗜酸細(xì)菌物種多樣性和遺傳多樣性的研究幾乎為空白,基于此這兩個(gè)細(xì)菌多樣性的研究是本課題的主要目標(biāo)之一。

5前景展望

在研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)行微生物優(yōu)勢群落的生理生化分析和限制多態(tài)性分析,可繼續(xù)進(jìn)行礦區(qū)酸性污水微生物類群多樣性的研究,進(jìn)而研究礦區(qū)酸性污水微生物類群的結(jié)構(gòu)和分布的特異性,進(jìn)而確定這些菌株分類學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位。由于條件有限,本研究許多方法、步驟還有待改進(jìn)和完善(比如在提取污泥中細(xì)菌的方法上我們有待改進(jìn)),在未分離和測序的種群中,還蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源,需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。隨著工業(yè)污水微生物資源研究理論的發(fā)展和研究技術(shù)的完善,人們必定從工業(yè)污水微生物中獲得矚目成果,更好地為人們的生產(chǎn)生活服務(wù)。

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